孟加榕，潘羨心，郭以河，溫路生，劉美蓮，禹 樂，戴太監(jiān)

分子靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)在肺腺癌患者的治療中已得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用［1-7］。研究證實EGFR-TKI與表皮生長因子受體(EGFR)的激活突變有關(guān)。因此患者在使用TKI藥物前需進(jìn)行EGFR基因突變檢測［1，2，8-10］。許多晚期肺腺癌患者因為失去了手術(shù)機(jī)會而難以獲得組織標(biāo)本，而胸腔積液是晚期該類患者常見的并發(fā)癥之一，且此標(biāo)本較容易獲取。已有研究證實高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是較準(zhǔn)確、敏感、快速且可用于臨床的基因突變檢測方法［11-13］。筆者前期已應(yīng)用HRM方法對肺腺癌患者胸腔積液上清液、細(xì)胞塊EGFR基因突變的臨床意義進(jìn)行了探討［14-15］。關(guān)于肺腺癌胸腔積液細(xì)胞塊及上清液成分進(jìn)行EGFR基因突變檢測的比較尚未見報道。本文旨在應(yīng)用HRM方法比較這兩種惡性胸腔積液成分EGFR基因突變狀態(tài)，為尋找有效的胸腔積液成分進(jìn)行高效快速EGFR基因突變檢測提供實驗依據(jù)，更好地為臨床服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集解放軍175醫(yī)院2010年9月—2013年5月臨床送檢胸腔積液標(biāo)本43例，細(xì)胞學(xué)涂片中均檢到癌細(xì)胞，胸腔積液細(xì)胞塊經(jīng)HE染色和免疫組化確診為肺腺癌，限定癌細(xì)胞量占細(xì)胞總量5%以上的樣本為合格樣本，用于后續(xù)實驗。43例中男21例，女22例;不吸煙患者32例，曾經(jīng)吸煙和目前仍吸煙患者11例;臨床分期均為Ⅲ～Ⅳ期，均未接受過TKI類藥物治療。

1.2 試劑胸腔積液上清液DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，美國QIAGEN公司);石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Tissue kit，美國QIAGEN公司);EGFR基因突變檢測試劑盒(廣州好芝生物科技有限公司)。

1.3 儀器 Light Cycle 480II實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司);熒光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司);Amoydx-Giraffe紫外分光光度計SMA4000(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 胸腔積液上清液制備方法:臨床送檢的新鮮胸腔積液標(biāo)本，取約12 ml置入15 ml離心管中，2000 r/min，離心5 min，收集上清液。

1.4.2 胸腔積液細(xì)胞塊制備方法:①臨床送檢新鮮胸腔積液，用15 ml尖底離心管取約12 ml胸腔積液，2000 r/min，離心5 min，棄上清，如細(xì)胞量過少，可重復(fù)離心，棄上清;②加入4%中性甲醛6 ml，震蕩混勻;③靜置 30 min左右，2000 r/min，離心5 min，棄上清;④用吸管將離心管底部的沉淀吸取至顯微鏡擦鏡紙上，包好，置入4%中性甲醛中固定，后經(jīng)組織脫水浸蠟，制成石蠟細(xì)胞塊。

1.4.3 DNA提取和定量分析:選擇經(jīng)HE染色和免疫組化確診為肺腺癌且癌細(xì)胞量占細(xì)胞總量5%以上的病例，試劑盒法分別提取其上清液和細(xì)胞塊DNA。將提取好的DNA樣本通過紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，將DNA濃度稀釋至4 ng/μl，濃度低于4 ng/μl的樣品直接取原液進(jìn)行實驗。

1.4.4 引物設(shè)計:采用引物設(shè)計軟件(primer premier 5．0)設(shè)計外顯子 18-21引物，并使用 Primer-BLAST軟件分析其特異性，確定熔解溫度。如表1所示，所有擴(kuò)增片段均＜250 bp，符合HRM小片段的要求。

表1 HRM-PCR引物序列

1.4.5 HRM法分析:應(yīng)用基于HRM-PCR技術(shù)的EGFR基因突變檢測試劑盒，對胸腔積液上清液DNA和細(xì)胞塊 DNA EGFR 基因第18、19、20、21外顯子分別進(jìn)行突變檢測。HRM-PCR反應(yīng)體系為10 μl，樣本 DNA(濃度 4 ng/μl)取 5 μl，檢測反應(yīng)液 3．9 μl，熒光染料 1 μl，DNA 聚合酶 0．1 μl，每個外顯子分別設(shè)野生對照和突變對照。配置好后，在LC480上按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行HRM檢測及結(jié)果分析。第一階段(酶激活階段):95℃、5 min;第二階段(PCR 擴(kuò)增階段):95℃、30 s，65℃、30 s(檢測熒光)，50個循環(huán);第三階段(熔解階段):95℃、30 s，40℃、30 s，70 ～ 90℃ (0．03℃ /s、連續(xù)熒光采集);第四階段(冷卻階段):4℃。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15．0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用χ2檢驗比較HRM方法檢測胸腔積液上清液和細(xì)胞塊EGFR第18、19、20、21外顯子突變率差異，α=0．05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 胸腔積液上清液和細(xì)胞塊EGFR基因突變率比較 HRM方法檢測上清液EGFR基因總突變率為39．53%(17/43)，細(xì)胞塊EGFR基因總突變率為34．88%(15/43)。兩種胸腔積液成分HRM方法檢測突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 胸腔積液上清液和細(xì)胞塊EGFR基因突變位點分布 胸腔積液上清液和細(xì)胞塊EGFR基因突變位點分布一致，均為第19、21外顯子突變，如圖1。上清液EGFR基因第19外顯子突變14例，第21外顯子突變3例;細(xì)胞塊EGFR基因第19外顯子突變12例，第21外顯子突變3例。胸腔積液細(xì)胞塊EGFR第21外顯子基因突變與上清液完全一致，為3例相同患者，如圖2A。胸腔積液上清液EGFR第19外顯子基因突變陽性而細(xì)胞塊陰性的病例3例，如圖2B。上清液EGFR第19外顯子突變陰性細(xì)胞塊檢測陽性的病例1例，如圖2C。

圖1 肺腺癌胸腔積液上清液和細(xì)胞塊表皮生長因子受體基因突變高分辨率熔解曲線圖

圖2 3例肺腺癌胸腔積液細(xì)胞塊(HE×200)

3 討論

筆者前期對收集的43例肺腺癌胸腔積液上清液和細(xì)胞塊分別進(jìn)行了EGFR基因突變檢測，結(jié)果表明HRM方法和基因測序法檢測突變率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，HRM方法檢測靈敏度優(yōu)于測序［14-15］。靈敏的基因檢測方法可以提高胸腔積液EGFR基因突變檢出率，可使更多的患者受益于EGFR-TKI藥物的治療。本文主要探討應(yīng)用HRM方法檢測同一肺腺癌患者胸腔積液上清液和細(xì)胞塊EGFR基因突變狀態(tài)，為尋找有效的胸腔積液成分進(jìn)行高效快速EGFR基因突變檢測提供實驗依據(jù)。

應(yīng)用HRM法檢測肺腺癌患者胸腔積液上清液和細(xì)胞塊標(biāo)本，兩者突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。EGFR基因突變類型一致，均為第19、21外顯子突變。胸腔積液細(xì)胞塊EGFR第21外顯子基因突變的結(jié)果與上清液完全一致，為相同患者。胸腔積液上清液EGFR第19外顯子基因突變檢測陽性而細(xì)胞塊檢測陰性的病例有3例，分析發(fā)現(xiàn)該3例患者均為女性，已屬肺腺癌Ⅳ期，胸腔積液中炎性細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞所占比例較大(最低達(dá)到80%)。上清液存在變性腫瘤細(xì)胞核碎片和DNA片段，成分較單一，干擾因素較少，且易于操作，重復(fù)性較好，胸腔積液離心后炎性細(xì)胞和間皮細(xì)胞處于中間層，紅細(xì)胞處于最底層，兩者對上清液結(jié)果影響不大，但經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后，過多的野生型DNA對細(xì)胞塊結(jié)果可能造成干擾，從而造成細(xì)胞塊EGFR結(jié)果假陰性。但上清液癌細(xì)胞數(shù)量不固定，有時癌細(xì)胞DNA含量較少，也易造成假陰性，這種情況下宜選取細(xì)胞塊進(jìn)行檢測。而上清液EGFR第19外顯子突變檢測陰性而細(xì)胞塊檢測陽性的病例有1例，為男性患者，實驗過程中發(fā)現(xiàn)該患者送檢胸腔積液腫瘤細(xì)胞含量很少，離心多次才富集而得細(xì)胞塊。上清液可能由于腫瘤DNA片段含量過少導(dǎo)致假陰性。

但胸腔積液細(xì)胞塊成分大部分為炎細(xì)胞、間皮細(xì)胞和紅細(xì)胞，干擾因素多，這些細(xì)胞所占比例較大的情況下檢測結(jié)果可能存在假陰性，故應(yīng)考慮上清液進(jìn)行EGFR基因突變檢測，簡單快速?？紤]存在假陰性的可能和腫瘤異質(zhì)性［16-20］，建議EGFR檢測前兼顧細(xì)胞學(xué)及HE結(jié)果，對腫瘤細(xì)胞含量和炎性細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等比例進(jìn)行評估，炎性細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等所占比例較大，腫瘤細(xì)胞含量較多的情況下宜選取上清液進(jìn)行檢測，腫瘤細(xì)胞含量較少，炎性細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等所占比例較少時宜富集細(xì)胞塊進(jìn)行突變檢測，臨界條件兩種成分兼顧，以保證結(jié)果的可靠性。因本研究用于兩種成分比較的樣品數(shù)仍較少，故后期將增加樣品數(shù)以獲得臨界條件的準(zhǔn)確值。

綜上所述，肺腺癌胸腔積液上清液和細(xì)胞塊可用于檢測其EGFR基因突變狀態(tài)，但由于存在假陰性可能以及腫瘤異質(zhì)性，建議EGFR檢測前兼顧細(xì)胞學(xué)及HE結(jié)果，對腫瘤細(xì)胞含量和炎性細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞等比例評估，以保證結(jié)果的可靠性。

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