汪巧英，應(yīng)濠澤，余佳寧，祝錦晶，徐自力，杜照奎＊，2，3

（1.臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000；2.浙江省植物進化生態(tài)學與保護重點實驗室，浙江 臺州 318000；3.臺州學院 生態(tài)研究所，浙江 臺州 318000）

花生蘋果酸脫氫酶基因的克隆及其蛋白序列分析

汪巧英1，應(yīng)濠澤1，余佳寧1，祝錦晶1，徐自力1，杜照奎＊1，2，3

（1.臺州學院 生命科學學院，浙江 臺州 318000；2.浙江省植物進化生態(tài)學與保護重點實驗室，浙江 臺州 318000；3.臺州學院 生態(tài)研究所，浙江 臺州 318000）

根據(jù)已知植物的蘋果酸脫氫酶基因序列設(shè)計簡并引物，采用RT-PCR技術(shù)從花生葉片中克隆得到蘋果酸脫氫酶基因，命名為AhMDH，Genbank登錄號為KF499119，該基因編碼區(qū)長度為1071bp，編碼356個氨基酸。序列比對結(jié)果表明，AhMDH編碼蛋白與大豆、蒺藜苜蓿和豌豆等具有較高的相似性。

花生；蘋果酸脫氫酶；克??；序列分析

0 引言

蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH，EC 1.1.1.37），廣泛存在于動、植物和微生物中，可以催化草酰乙酸與蘋果酸之間的可逆轉(zhuǎn)換。MDH可催化草酰乙酸生成蘋果酸，使NAD+生成NADH，為硝酸還原過程提供還原力［1］；胞質(zhì)中生物氧化產(chǎn)生的NADH不能通過線粒體內(nèi)膜，但NADH可在MDH作用下將氫交給草酰乙酸生成蘋果酸，后者可通過蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)被運送到線粒體基質(zhì)，線粒體基質(zhì)中的蘋果酸被重新氧化成草酰乙酸和NADH，然后通過呼吸鏈進行氧化［2］。因而，MDH參與了植物眾多生理活動，如三羧酸循環(huán)、脂肪酸的合成、氮同化和氨基酸的合成等。研究表明，MDH在植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育、果實成熟等方面起著重要作用。

目前，人們已經(jīng)陸續(xù)水稻［3］、小麥［4］、玉米［5］、香蕉［6］、甘蔗［7］、大白菜［8］和蘋果［9］等植物中克隆出MDH基因?；ㄉˋrachis hypogaea L.）是豆科落花生屬一年生草本植物，富含脂肪和蛋白質(zhì)，為重要的食用植物油來源，但至今尚未見花生MDH基因序列及表達情況的報道。前期蛋白質(zhì)組學研究表明，受到UV-B輻射處理24h后，花生MDH表達量下調(diào)。本文采用RT-PCR技術(shù)克隆花生蘋果酸脫氫酶基因（AhMDH），并進行序列分析，為進一步驗證其在耐受UV-B等逆境脅迫的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生品種為“小京生”，種子購自新昌縣種子公司。2013年3月5日播種，4月8日采集幼嫩、健康的葉片，75%酒精擦拭后立即提取總RNA。

大腸桿菌 （Escherichia coli）菌株DH5α由本室保存。pUCm-T載體、總RNA提取試劑盒、cDNA的合成試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自碧云天公司；dNTP、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、

DNA Marker DL2000、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、氨芐青霉素、瓊脂糖和DEPC購自上海生工公司；胰蛋白胨和酵母提取物產(chǎn)自英國OXOID公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

上、下游引物分別為MDHF：5’-ATGGA（A/G）GCA（A/T/C）（A/G）TGCAGCGG-3’和MDHR：5’-TTATTTTCTGATGAA（A/T）（T/G/C）（C/A）TATC-3’，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 葉片總RNA提取和cDNA的合成

花生葉片總RNA的提取和cDNA的合成按照試劑盒提供的說明書進行。取3 μL RNA于1%瓊脂糖凝膠上進行非變性電泳，檢測RNA的完整性。通過Nanodrop ND-2000超微量分光光度計測定RNA濃度。

1.3 PCR擴增體系和程序

擴增體系：反轉(zhuǎn)錄cDNA約50ng作為模板，引物終濃度為10μmol·L-1，dNTP終濃度為100μmol·L-1，Taq酶1U，加無菌水至總體積10μL。

PCR反應(yīng)在美國Bio-Rad MyCycler熱循環(huán)儀中進行，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，55℃退火45s，72℃延伸90s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.4 PCR產(chǎn)物的回收、連接與測序

PCR產(chǎn)物的回收按試劑盒說明書進行，回收產(chǎn)物與pUCm-T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑及菌液PCR初步篩選陽性克隆菌，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序確認。

1.5 序列分析

通過ExPASy（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）進行蛋白質(zhì)的疏水性分析，運用PSORT （http://psort.hgc.jp/form.html） 進行亞細胞定位； 運用 SOPM （http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html）預(yù)測其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)；運用CDD（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行保守區(qū)分析；運用SWISS-MODEL進行結(jié)構(gòu)域的三維建模。在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載其它物種蘋果酸脫氫酶基因，用軟件MEGA4.1 NJ法（Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1000次bootstrap檢驗系統(tǒng)發(fā)生樹可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 花生葉片總RNA的提取和檢測

花生葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），28S RNA和18S RNA條帶清晰可見，兩者亮度基本接近2:1，表明總RNA沒有明顯的降解，完整性較好；紫外分光光度計測定OD260=0.898、OD280= 0.454，通過計算OD260/OD280=1.98，說明純度較高，可用于后續(xù)試驗研究。

圖1 花生葉片總RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Total RNA from Arachis hypogaea leaves separated on agarose gel

2.2 花生蘋果酸脫氫酶基因的克隆

提取花生葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板、分別以MDHF和MDHR為引物對進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：在DNA Marker DL2000的1 000bp和2 000bp之間獲得一條特異性擴增的條帶，PCR擴增產(chǎn)物純度較高，大小約為1 700bp（圖2）。

圖2 花生AhMDH基因RT-PCR擴增結(jié)果Note:Lane M is DNA Marker DL2000;Lane 1 and 2 are AhMDH PCR productsFig.2 Amplification of gene MDH from A.hypogaea by RT-PCR

2.3 陽性克隆質(zhì)粒的鑒定

RT-PCR產(chǎn)物分別回收純化后，與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，從氨芐青霉素抗性平板上挑取白色單菌落進行短時培養(yǎng)，菌液PCR結(jié)果顯示 （圖3），加樣孔1、2和4在DL 2000的1 000～2 000bp處出現(xiàn)單條清晰條帶，大小與圖2較吻合，初步估計所挑菌落為陽性克隆。測序結(jié)果表明目的片段長度分別為1 071bp，將其命名為AhMDH，序列已提交NCBI網(wǎng)站，登錄號為KF499119。

圖3 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果Note:Lane M is DNA Marker DL2000;Lane 1-4 are colony PCR product of AhMDH from transformated LB plate.Fig.3 Identification of recombinant plasmid pUCm-T-MDH by PCR

2.4 AhMDH序列分析

ProtParam顯示，AhMDH基因編碼蛋白分子式C1668H2711N461O495S11；由356個氨基酸組成（圖4），所含氨基酸組成以Ala最多，酸性氨基酸（Asp和Glu）和堿性氨基酸（Lys和Arg）個數(shù)均為37；相對分子質(zhì)量為37.50 KD；等電點為6.97；不穩(wěn)定指數(shù)分別為24.65，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖4 AhMDH基因的編碼區(qū)及推導的氨基酸序列Fig.4 Coding sequence of AhMDH gene and its deduced amino acid sequence

使用PSORT在線程序預(yù)測蛋白的亞細胞定位特性，結(jié)果表明：MDH蛋白可能定位于線粒體基質(zhì)。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，MDH中含有三種結(jié)構(gòu)域，分別是輔酶NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域、MDH二聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖5 AhMDH基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.5 Prediction of conserved domain in AhMDH protein

2.5 AhMDH編碼蛋白序列比對分析

為比較不同植物已知MDH基因的序列差異和進化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載大豆 （Glycine max，登錄號：BAG09381.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，登錄號：AES90524.1）、豌豆（Pisum sativum，登錄號：AAO27260.1）、歐洲油菜（Brassica napus，登錄號：CAB43995.1）、毛果楊（Populus trichocarpa，登錄號：EEE87160.1）、紫蘇（Perilla frutescens，登錄號：ABW79813.1）、克萊門柚（Citrus clementina，登錄號：ESR35923.1）、蓖麻（Ricinus communis，登錄號：EEF40237.1）、葡萄（Vitis vinifera，登錄號：CAN65552.1）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii，登錄號：EMT13267.1）、薺菜（Capsella rubella，登錄號：EOA30902.1）、番茄（Solanum lycopersicum，登錄號：AAU29200.1）、野草莓 （Fragaria vesca subsp. vesca，登錄號：XP_ 004289711.1）、黃瓜（Cucumis sativus，登錄號：XP_004143423.1）、毛竹（Phyllostachys edulis，登錄號：ADB85313.1）、白綠竹（Bambusa oldhamii，登錄號：ACN62414.1）、水稻（Oryza sativa Japonica Group，登錄號：EEE53658.1）、高粱（Sorghum bicolor，登錄號：EES17483.1）、玉米（Zea mays，登錄號：ACF87717.1）和大麥（Hordeum vulgare subsp.vulgare，登錄號：BAJ99028.1）序列。用DNAMAN軟件對其蛋白質(zhì)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，MDH在不同物種間的相似性較高，除N端有差異性較大外，其它區(qū)域相對保守（圖6），花生與

大豆的相似性最高，為92.13%，與玉米的相似性最低，僅為78.37%。

圖6 AhMDH編碼蛋白序列與同源蛋白序列的比對Fig.6 Multi-alignment of AhMDH deduced amino acid sequences with its homologous genes

運用Mega 5.0軟件采用Neighbor-Joining法對AhMHD編碼蛋白質(zhì)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明：單子葉（節(jié)節(jié)麥和大麥、毛竹、水稻、高粱和玉米）植物和雙子葉植物各聚為一大組（圖6），雙子葉植物中同為豆科的花生與大豆、蒺藜苜蓿和豌豆聚為一組，親緣關(guān)系最近；十字花科的歐洲油菜和芥菜聚為一組，這與傳統(tǒng)的植物學分類結(jié)果一致。

圖7 AhMDH基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogentic tree of AhMDH deduced amino acid sequence and its homologous sequences

蘋果酸脫氫酶可以催化草酰乙酸與蘋果酸之間的可逆轉(zhuǎn)換，在植物細胞內(nèi)參與了眾多生理活動，如三羧酸循環(huán)、氮同化、脂肪酸和氨基酸的合成等，因而，MDH在植物種子萌發(fā)、生長發(fā)育和果實成熟等方面起著重要作用。此外，在應(yīng)對逆境脅迫中，MDH也具有重要作用，如Yao等［9］在蘋果和番茄中過表達MDH后，發(fā)現(xiàn)兩種植物對低溫和鹽脅迫抗性提高；Wang等［10］在番茄中過表達MDH也發(fā)現(xiàn)其對Al的抗性增強，但過表達MDH是否會提高植物對UV-B的抗性尚未見報道。本研究從花生葉片中克隆了花生蘋果酸脫氫酶基因AhMDH，下一步擬構(gòu)建真核表達載體，將此基因轉(zhuǎn)入花生中，進行過量表達，檢測能否提高其對UV-B的抗性。

3結(jié)論

花生蘋果酸脫氫酶基因AhMDH（Genbank登錄號為KF499119），長度為1071bp，編碼356個氨基酸，相對分子質(zhì)量為37.50KD。該蛋白可能定位于線粒體基質(zhì)，含有三種結(jié)構(gòu)域，分別是輔酶NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域、MDH二聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域。AhMDH編碼蛋白與大豆、蒺藜苜蓿和豌豆等具有較高的相似性。

［1］Scheibe R.Malate valves to balance cellular energy supply［J］.Physiologia Plantarum,2004,120（1）:21-26.

［2］Goward C R,Nicholls D J.Malate dehydrogenase:a model for structure,evolution,and catalysis［J］.Protein Science,1994,3（10）:1883-1888.

［3］Lin C-F,Jiang L-Z,Zhang X-N,et al.Cloning and prokaryotic expression of a cDNA encoding a putative mitochondrial malate dehydrogenase in Oryza sativa［J］.Mitochondrial DNA,2003,14（1）:75-77.

［4］藺占兵,徐洋,馬慶虎,等.小麥中一類依賴于NAD的細胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶cDNA的克隆和進化樹分析 ［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2004,12（1）:38-42.

［5］胡建廣,趙相山,劉軍,等.玉米蘋果酸脫氫酶基因的分離與結(jié)構(gòu)分析 ［J］.植物學報,1999,41（1）:40-44.

［6］張建斌,賈彩紅,鄧秋菊,等.香蕉蘋果酸脫氫酶基因克隆及其逆境脅迫表達 ［J］.西北植物學報,2012,32（10）: 1942-1949.

［7］徐景升,闕友雄,顏克偉,等.甘蔗細胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因的克隆及其表達分析 ［J］.熱帶亞熱帶植物學報,2012, 20（5）:455-461.

［8］賈晉,張魯剛.大白菜蘋果酸脫氫酶基因的克隆及序列分析 ［J］.園藝學報,2009,36（3）:363-368.

［9］Yao Y X,Dong Q L,Zhai H,et al.The functions of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene in growth and tolerance to cold and salt stresses［J］.Plant Physiology and Biochemistry,2011,49（3）:257-264.

［10］Wang Q F,Zhao Y,Yi Q,et al.Overexpression of malate dehydrogenase in transgenic tobacco leaves: enhanced malate synthesis and augmented Al-resistance［J］.Acta Physiologiae Plantarum,2010,32（6）:1209-1220.

Cloning and Sequence Analysis of Malate Dehydrogenase Gene from Arachis hypogaea L.

WANG Qiao-ying1，YING Hao-ze1，YU Jia-ning1，ZHU Jin-jing1，XU Zi-li1，DU Zhao-kui1，2，3*

（1.School of Life Sciences,Taizhou University,Taizhou 318000,China; 2.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Evolutionary Ecology and Conservation,Taizhou 318000,China; 3.Institute of Ecology,Taizhou University,Taizhou 318000,China）

In this paper, degenerate primers were designed according to reported malate dehyrogenase gene sequences.The coding sequence of malate dehyrogenase gene (AhMDH) numbered KF499119 was amplified by RT-PCR from cDNA of Arachis hypogaea L.The sequence of AhMDH is 1071 bp in length encoding 356 amino acid.Multiple sequence alignment analysis showed that A.hypogaea,Glycine max,Medicago truncatula and Pisum sativum share high homology.

Arachis hypogaea;malate dehyrogenase;gene cloning;sequence analysis

10.13853/j.cnki.issn.1672-3708.2014.06.008

（責任編輯：耿繼祥）

2014-05-05；

2014-05-12

浙江省教育廳科研項目（Y201223322）；2014年浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃（新苗人才計劃）（2014R428013）。

簡介：杜照奎（1979- ），男，湖北隨州人，講師，博士，主要從事植物分子生態(tài)學研究。