腫瘤相關巨噬細胞通過分泌IL-10 影響上皮性卵巢癌腫瘤微環(huán)境中T 細胞亞群Treg/Th17 失衡①

吳小麗 張 婷 王昕婧 王 凱 汪希鵬 (同濟大學附屬第一婦嬰保健院婦科，上海 200040)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，Eoc)是目前婦產(chǎn)科腫瘤中致死率最高的疾病。多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于臨床晚期，表現(xiàn)為腹腔廣泛轉(zhuǎn)移［1］。這一臨床特征提示患者預后不良，5 年生存率僅為30%左右［2］。研究發(fā)現(xiàn)，腹膜是Eoc 轉(zhuǎn)移的最常見部位［3］。我們課題組前期研究證實:Eoc 腹膜種植灶浸潤的免疫細胞中數(shù)量最豐富的是巨噬細胞(70%)，其次為CD4+T 細胞(25%)［4］，CD4+T 細胞可以分化為兩種T 細胞亞群，一種是分泌IL-17的Th17 細胞［5］，另一種是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞［6］(regulatory T cells，Treg cells)。Th17 與Treg 比例平衡與腫瘤進展關系密切。有研究顯示，胃癌腫瘤微環(huán)境中，Treg/Th17 的比值增加，與胃癌進展有關［7］。課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者外周血及卵巢癌微環(huán)境中Treg/Th17 細胞比例同樣表現(xiàn)上升趨勢(文章待發(fā)表)，由于卵巢癌腹膜微環(huán)境中的免疫細胞主要以巨噬細胞為主，因此本課題旨在探討Treg 細胞與Th17 細胞是否受巨噬細胞調(diào)控，闡述卵巢癌微環(huán)境缺陷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清、青-鏈霉素、PBS、胰蛋白酶購自Gibco 生物技術(shù)公司;Triton X-100 購自aMResco 公司;抗人CD14 及CD4磁珠，配套分選柱及分選裝置購自德國美天旎公司，CD3、CD28 抗體購自BD Bioscience 公司，PE 標記的鼠抗人IL-17 抗體、Percp-cy5.5 標記的鼠CD4 抗體、APC 標記的Foxp3 抗體，相關同型對照抗體以及破膜劑均購自eBioscience 公司;結(jié)晶紫、甲醇、脫氧膽酸鈉，均購自國藥集團化學試劑公司;ELISA 試劑盒購自R＆D 公司;DAPI 核熒光染料購自Sigma公司;Transwell 專用24 孔板購自Conning 公司;Western 特異性抗體購自Abcam 公司;內(nèi)參及相關裂解液購自CST 公司;Skov-3 細胞系，購自中科院細胞庫。其余耗材由上海市第一婦嬰保健院中心實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 CD14+單核細胞及CD4+T 細胞的分離和培養(yǎng) 外周血單個核細胞由上海市血液中心提供，外周血PBMC 中的CD14+單核細胞以及CD4+T 細胞采用MACS 磁珠分選計數(shù)進行純化，具體步驟如下:將分選柱置于Mini MACS 分選器上，將密度梯度離心后得到的外周血單個核細胞用PBS 緩沖液按80 μl/107個細胞重懸。加入CD14 微珠20 μl/107個細胞，混勻，4～8℃孵育15 min，PBS 緩沖液1 ml/107個細胞洗滌細胞，1 500 r/min 離心10 min，完全去除上清，用500 μl PBS 緩沖液重懸，所得細胞懸液加入MS 分選柱中，收集先行流出的未標記細胞組分，并用1 500 μl 緩沖液沖洗MS 柱，此為CD14陰性細胞。將分選柱移出磁場，1 ml 緩沖液快速將分選柱上滯留的細胞洗脫下來，這些細胞即是磁性標記的CD14 陽性單核細胞。將CD14 陰性的細胞繼續(xù)用CD4 微珠標記后重復上述步驟，分選得到CD4 陽性的T 細胞。將磁珠分選得到的細胞重懸于RPMI1640 全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的溫箱中培養(yǎng)。分離得到的CD4+T 細胞或CD14+單核細胞純度都在90%以上。

1.2.2 巨噬細胞誘導分化及T 細胞的活化 磁珠分選得到的CD14+單核細胞以每孔106個鋪于6 孔板中，分別加入M-CSF(25 ng/ml)，M-CSF(25 ng/ml)+LPS(100 ng/ml)+IFN-γ(20 ng/ml)，M-CSF(25 ng/ml)+IL-4(20 ng/ml)于RPMI1640 全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d，誘導為M0、M1、M2 型巨噬細胞［8］。磁珠分選得到的CD4+T 細胞，培養(yǎng)于預先包被有CD3(10 μg/ml)抗體的6 cm 培養(yǎng)皿中，同時加入CD28抗體(10 μg/ml)。培養(yǎng)3 d。

1.2.3 巨噬細胞與T 細胞共培養(yǎng) 將活化后的T細胞在6 孔板中以5×105個/每孔與巨噬細胞(M0、M1、M2 三組)共培養(yǎng)，以1640 全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)3 d 后進行下一步實驗。

1.2.4 流式檢測共培養(yǎng)后T 細胞中Th17、Treg 占CD4+T 細胞比例 共培養(yǎng)后的CD4+T 細胞用Percpcy5.5-CD4 抗體，PE-IL-17 抗體及APC-Foxp3 抗體標記，用流式檢測Th17 細胞及Treg 細胞占CD4+T 細胞的比例。方法如下:取約1×106細胞重懸于100 μl 緩沖液中，加入FcR 抗體封閉10 min 后加入5 μl 的CD4 抗體，充分混勻，于4℃避光孵育30 min，用PBS洗2 遍后加入破膜劑，4℃避光孵育45 min，PBS 洗2遍后加入IL-17 及Foxp3 抗體，4℃避光孵育30 min，PBS 洗2 遍，500 μl 重懸，上機檢測。結(jié)果用陽性細胞占CD4+T 細胞百分比表示。由于IL-17 是分泌型蛋白，所以CD4+T 細胞在流式檢測前預先加入佛波酯(PMA)，離子霉素和莫能霉素的混合物(eBioscience)刺激4～6 h 后進行抗體染色。

1.2.5 Western blot 檢測共培養(yǎng)后T 細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的表達 蛋白質(zhì)抽提:將共培養(yǎng)后的T 細胞離心棄上清，在離心管中加入適量預冷的含抑制劑PMSF 的RIPA 蛋白質(zhì)裂解液，經(jīng)變性，電泳，轉(zhuǎn)膜后，5% 脫脂牛奶封閉，加入一抗過夜，一抗分別是小鼠抗人Gabdh 抗體(1∶5 000)，小鼠抗人Foxp3 抗體(1∶200)，小鼠抗人RORrt 抗體(1∶5 000)。TBST漂洗3 次后用相應的羊抗小鼠二抗 室溫孵育1 h后，漂洗，用ECL 發(fā)光液(millipore)顯色，拍攝。

1.2.6 腫瘤細胞增殖實驗 人卵巢癌細胞系Skov-3 細胞以5 000 個細胞每孔鋪于96 孔板，將共培養(yǎng)后的上清和RPMI1640 全培養(yǎng)基1∶1混合后加入，200 μl 每孔。培養(yǎng)1 d、2 d 后用結(jié)晶紫法檢測腫瘤細胞增殖情況，6 個復孔，重復3～5 次，鋪板同時以5 000～20 000 個Skov-3 細胞/孔的濃度梯度鋪板，貼壁后以結(jié)晶紫法檢測，獲得濃度梯度曲線，方程為:y=39 773x-2 814，R2=0.991(其中x 為測得熒光值)將后兩天測得各孔熒光值代入方程計算，得出細胞數(shù)。

1.2.7 腫瘤細胞遷移實驗 人卵巢癌細胞系Skov-3 以每孔1.5×105個鋪于專用24 孔transwell 板中，上室加入200 μl 含有1%血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，下室加入800 μl 的共培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基。20 h 后下室中的細胞用熒光染料染色，用熒光顯微鏡觀察細胞穿透的情況，每個孔取6 個視野計數(shù)。

1.2.8 ELISA 檢測上清中IL-10 的含量 收集M0、M1 及M2 巨噬細胞與CD4+T 細胞共培養(yǎng)體系中的共培養(yǎng)上清，用于檢測上清中IL-10 的濃度，具體操作步驟完全按照R＆D 公司生產(chǎn)的IL-10 ELISA 試劑盒說明書。簡要步驟如下:上清100 μl 加入預包被的96 孔板中，室溫搖床孵育2 h，Wash Buffer 清洗4 次后加入IL-10 結(jié)合抗體，室溫搖床孵育2 h，Wash Buffer 清洗4 次，加入顯色劑，孵育30 min，室溫避光，加入中止液，酶標儀450nm 檢測讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理用SPSS 軟件13.0，計量資料以±s 表示，Treg/Th17 比值變化用t 檢驗，Western 數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗，細胞增殖用ONEWAY ANOVA，遷移用Kruskal Wallis 檢驗，IL-10 含量用ONEWAY ANOVA。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 M2 型巨噬細胞通過影響T 細胞轉(zhuǎn)錄因子，誘導Treg/Th17 比值上調(diào) CD4+T 細胞與M0、M1、M2型巨噬細胞共培養(yǎng)3 d 后用流式檢測共培養(yǎng)后的CD4+T 淋巴細胞中Th17 (CD4+IL-17+)和Treg(CD4+Foxp3+)比例，發(fā)現(xiàn)與M2 型巨噬細胞共培養(yǎng)后的CD4+T 細胞中Treg/Th17 比值為0.76±0.33 相比Control 組0.41±0.25，M0 組0.40±0.32 與M1 組0.31±0.16 有顯著增高(P＜0.05)，而Control 組、M0組、M1 組之間沒有統(tǒng)計學差異(圖1A、B)。

圖1 M2 型巨噬細胞誘導Treg/Th17 比例上升Fig.1 M2 macrophage induce increase of ratio of Treg/Th17

Foxp3 是Treg 細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，而RORrt 是Th17 細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子。收集與巨噬細胞共培養(yǎng)后的CD4+T 細胞，分析T 細胞中的這兩種轉(zhuǎn)錄因子含量的變化，發(fā)現(xiàn)與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)后的T 細胞中Foxp3 蛋白的含量相對于M1組增加(P=0.047)，而RORrt 的含量出現(xiàn)下降趨勢但沒有統(tǒng)計學差異(P=0.294)(圖2)。

圖2 M2 型巨噬細胞誘導Foxp3 增多Fig.2 M2 macrophage induced increase of Foxp3 expression

2.2 巨噬細胞誘導T 細胞格局變化，促進腫瘤細胞的增殖和遷移 將巨噬細胞與T 細胞共培養(yǎng)的上清加入Skov-3 的培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)1 d 后，全培養(yǎng)基組(Control 組)數(shù)量為12 445.57±179.34，CD3/28組為 12 470.32 ± 434.18，M2 組 明 顯 上 升為14 942.43±434.19，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.001);共培養(yǎng)2 d 后，Control 組細胞數(shù)增長為25 622.81±897.07，CD3/28 組為25 721.62±1 808.60，M2 組顯著提高為30 129.09±520.53，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)(圖3C)。同時，在比較了上清對腫瘤細胞遷移能力的影響后發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，Control 組遷移的腫瘤細胞數(shù)為(92.25±17.16)個，CD3/28組為(157.87±18.41)個，M2 組為(534±62.66)個，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001)(圖3A、B)。

2.3 腫瘤相關巨噬細胞分泌IL-10 增多促進Treg分化 用ELISA 法檢測共培養(yǎng)后上清中IL-10 的含量發(fā)現(xiàn)，在M2 與CD4+T 細胞共培養(yǎng)的上清中，IL-10 的含量為(264.04±75.9)pg/ml，較CD3/28 組(60.89±46.54)pg/ml，M0 組(44.81±32.93)pg/ml，M1 組(42.71 ±26.09)pg/ml 均 顯 著 提 高(P=0.001)。見圖4。

圖3 不同共培養(yǎng)上清對Skov-3 增殖和遷移的影響Fig.3 Effect of different co-culture supernatant on proliferation and migration of Skov-3 cells

圖4 共培養(yǎng)上清中IL-10 含量的差異Fig.4 Level of IL-10 in supernatant of four groups

3 討論

幼稚的CD4+T 細胞可以分化為四種類型的T細 胞:Th1、Th2、Th17 和 Treg (regulatory T cells)［9，10］。Th17 細胞主要以分泌IL-17 為特征，同時還可以分泌IL-21、IL-22 和IL-26，在自身性免疫及過敏反應中起到很大的作用［11，12］。而Treg 細胞是一種免疫負調(diào)控細胞，多項研究顯示Treg 細胞不僅在免疫耐受中扮演著重要的角色，在腫瘤的免疫逃逸中也有一定作用。鑒于這兩種細胞在多種惡性腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)，并且都存在增高的現(xiàn)象〔12-14〕。因此單獨分析一種細胞并不能夠真實反映疾病的進展情況，所以采用兩者比例平衡來研究腫瘤微環(huán)境中的免疫格局。

一些研究證實，在多種腫瘤中都有關于Treg/Th17 失衡的現(xiàn)象。在HER2+乳腺癌患者的研究中，外周血Treg/Th17 比例顯著高于HER2-患者和健康人［15］。在肺鱗狀細胞癌和腺癌的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)［16］。而課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)在卵巢癌患者的腫瘤組織及腹膜中Treg/Th17 的比例同樣存在失衡，較良性腫瘤及正常對照組都有增高的現(xiàn)象(文章投稿中)。有關上皮性卵巢癌中這一比例失衡的機制，目前未見報道。課題組猜測卵巢惡性腫瘤組織及腹膜中Treg/Th17 比例失衡是否是由卵巢癌微環(huán)境中占免疫細胞70%的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)所調(diào)控。我們體外的共培養(yǎng)實驗結(jié)果證實了這一猜想。因為M2 型巨噬細胞與TAM 細胞極為相似，我們將外周血單核細胞誘導為M2 型巨噬細胞與CD4+T 細胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)3 d 后，CD4+T細胞中的Treg/Th17 平衡發(fā)生變化，較對照組、M0及M1 組都有顯著增高。同時T 細胞中的特異性轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)生了相應的變化，Treg 的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 出現(xiàn)顯著上調(diào)。

這一結(jié)果說明TAM 細胞在腫瘤微環(huán)境中已經(jīng)不僅僅作為抗原提呈細胞發(fā)揮作用，同時還能影響微環(huán)境中CD4+T 細胞的比例構(gòu)成。目前在腫瘤微環(huán)境的研究中未見類似報道，但是在血吸蟲的研究中發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞對炎癥環(huán)境中Treg/Th17 平衡的影響，通過調(diào)控Treg 細胞比例增大，來抑制急性炎癥對腸道組織的損傷［17］。

多項研究表明，TAM 細胞能通過分泌VEGF 等因子促進腫瘤血管生成［18］，從而為腫瘤組織提供充足的營養(yǎng)。那么TAM 對Treg/Th17 平衡的調(diào)節(jié)對腫瘤細胞而言是否具有某些意義，為了證實這一想法，課題組對M2 型巨噬細胞和T 細胞共培養(yǎng)上清進行研究，發(fā)現(xiàn)TAM 細胞與T 細胞共培養(yǎng)后的上清具有顯著增強腫瘤細胞增殖和遷移的能力。這與其促進腫瘤血管的生物學行為相統(tǒng)一，通過調(diào)節(jié)T 細胞格局與血管生成共同促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

M2 型巨噬細胞以高表達CD163、CD206 及IL-10 區(qū)別于其他類型的巨噬細胞［19］。而IL-10 作為一種炎癥負調(diào)控因子，在Treg 及Th17 的分化中扮演著重要的角色。在Glock 等［20］的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-10 能夠激活Treg 細胞中的STAT3 通路，高表達IL-10R，同時抑制Th17 的功能。存在IL-10R 突變的個體將大大增加其患有難治性克羅恩病的風險。缺乏Foxp3、IL-10R 及STAT3 中任意一個基因的小鼠都會出現(xiàn)難以抑制的Th17 介導的結(jié)腸炎［21］。最近也有研究證明，抑制小鼠IL-10 受體，可以增強疫苗介導的CD8+T 細胞的抗腫瘤能力［22］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，M2 型巨噬細胞與T 細胞的共培養(yǎng)上清中的IL-10 含量遠遠高于對照組，我們猜測上皮性卵巢癌微環(huán)境中的TAM 細胞可能通過分泌大量的IL-10，激活Treg 細胞中的STAT3 通路，同時抑制Th17，最終導致了Treg/Th17 比例失衡，同時又通過抑制CD8+T 細胞的抗腫瘤能力，從多方面促進腫瘤的增殖和遷移。因此，研究針對TAM 細胞的靶向治療藥物，能夠有效地改變腫瘤的免疫微環(huán)境，促進機體的抗腫瘤免疫，從而為上皮性卵巢癌的治療開辟新的路徑。

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