朱建光 袁 青 黃 黎 徐文峰 年四季 (瀘州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州646000)

人胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種新型的、與白細(xì)胞介素-7(IL-7)類似的細(xì)胞因子，當(dāng)過敏性炎癥反應(yīng)時在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞高度表達(dá)，能強烈刺激髓系樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)介導(dǎo)的Th2 型炎癥反應(yīng)發(fā)生［1，2］。1994 年，由Firend 等［3］首次從胸腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離獲得，但是在隨后幾年時間里對TSLP 的研究進(jìn)展緩慢，2000年后，隨著對TSLP 及其受體(TSLPR)的克隆和測序，人們對其功能才有了較全面的了解，特別是在闡明過敏性炎癥疾病的發(fā)病機制方面有了更新的認(rèn)識。TSLP 分子主要作用于CD11c+DC，對DC 的活化、分化起著重要的調(diào)控作用。該受體復(fù)合物由IL-7R 和另一公用ε 鏈類似分子(εcR)組成的異源二聚體構(gòu)成［4］。研究顯示，CD11c+DC 可同時表達(dá)IL-7R 和εcR，而這種現(xiàn)象在其他細(xì)胞則較少見。受TSLP 作用而被激活的CD11c+DC 可促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞增殖，分泌大量IL-5、IL-13 及TNF-α［5，6］。同時，CD8+T 細(xì)胞在TSLP 激活DC 的作用下，可產(chǎn)生大量IFN-γ、IL-5 和IL-13。IL-5、IL-13 和IFN-γ 水平的升高，可導(dǎo)致炎性反應(yīng)的加劇以及組織損傷，表明TSLP 可能是過敏性炎癥發(fā)生過程中一個重要的啟動因子［7］，為治療過敏性炎癥疾病的主要靶分子。

基于TSLP 在過敏性炎癥發(fā)生過程中起到的重要作用，制備抗TSLP 全人源單鏈抗體，從而封阻TSLP 的生物學(xué)活性，對于治療過敏性炎癥疾病提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 Invitrogen 公司合成TSLP cDNA;pET101/ D-TOPO 載體、Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)、蛋白預(yù)染Marker(BenchMarkTMpre-stained protein ladder)、鏈霉親和素M-280 免疫磁珠(streptavidincoated Dynabeads M-280)購自Invitrogen 公司;Ex Taq 酶、DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量(1 000 bp DNA ladder)、低分子量蛋白Marker 購自TaKaRa 公司;E.coli L21、E.coli DH5aF'、E.coli TG1、輔助噬菌體M13K07 及pCANTAB-5E 噬菌體載體均購自Gene 公司;EZLink (tm)Sulfo-NHS-LC-Biotin 生物素購自Thermo Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 TSLP 基因擴增 公司合成TSLP cDNA，根據(jù)基因序列，設(shè)計引物。用于擴增TSLP 的上游引物TSLPF1-Forword:5' CACCATGTTCCCTTTT-GCCTTACT 3'，下游引物TSLPR1-Reverse:5' CTGTTGTTTCAGTAAGGGTCG 3' 。取 10 ng/μl TSLP cDNA 2 μl 作為模板，進(jìn)行PCR 擴增。擴增程序為94℃2 min，然后94℃30 s，55℃30 s，72℃1 s，30次循環(huán)，最后延伸72℃10 min。

1.2.2 TSLP 的表達(dá)純化 取TSLP PCR 產(chǎn)物，按照pET Directional kit (Invitrogen，USA)說 明 書 與pET101/D-TOPO 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli One Shot-TOPO，PCR 鑒定陽性克隆子，提取陽性克隆子質(zhì)粒，測序驗證正確后，將含正確序列的TSLP/pET101陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21。挑單克隆子過夜培養(yǎng)后取5 ml 接種到100 ml LB 含50 μg/ml 羧芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600=0.6 左右，加入終濃度為1 mmol/L IPTG 于37℃，180 r/min 培養(yǎng)5 h 后，8 000 r/min 離心15 min，收集沉淀用于SDS-PAGE 鑒定和后續(xù)純化。

按Invitrogen 公司的Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)說明書對表達(dá)的TSLP 蛋白進(jìn)行純化，并進(jìn)行Western blot鑒定。由于pET101/D-TOPO 載體帶有6 × His-tag，鑒定表達(dá)、純化的蛋白采用抗His-tag(GE Healthcare，來源于小鼠)和羊抗小鼠(IgG)辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體(Promega，USA)，最后加入化學(xué)發(fā)光劑(Luminata Crescendo Western HRP substrate，USA)進(jìn)行顯色。

1.2.3 抗TSLP 全人源單鏈抗體的篩選 本實驗前期已構(gòu)建了天然全人源scFv 抗體文庫，文庫容量達(dá)到2.5×108，多樣性好［8］，純化的TSLP 蛋白根據(jù)EZ-Link (tm)Sulfo-NHS-LC-Biotin 試劑盒說明書(Thermo Scientific)進(jìn)行生物素化。約5×1011TU 新鮮配制的scFv 抗體文庫噬菌體用封閉液于室溫封閉1 h，加入15 μg 生物素化蛋白于封閉后的scFv抗體文庫噬菌體中，于室溫緩慢振蕩孵育1 h，靜置1 h;按說明書加入室溫封閉1 h 后的鏈霉親和素M-280 免疫磁珠于混合液中，室溫緩慢振蕩30 min 捕獲TSLP 蛋白/抗TSLP 特異性噬菌體復(fù)合體。用1×PBS 和1×PBST(1×PBS 含0.05% Tween 20)緩沖液各洗滌磁珠5～10 次，然后用0.1 mol/L Glyline-HCl (pH2.2)使特異性噬菌體解離，感染大腸桿菌TG1 后涂2×YTAG (2×YT 固體培養(yǎng)基平板含100 μg/ml 氨芐青霉素和2% 葡萄糖)，從平板上洗下所有菌落用于噬菌體文庫擴增。分別以7 μg、3 μg 生物素化的TSLP 蛋白用于第2 輪和第3 輪抗體的篩選。

1.2.4 噬菌體擴增 取200 μl 從平板上洗下的抗體文庫菌液加入到30 ml 2×YTAG 培養(yǎng)基中，于37℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600=0.2。離心收集細(xì)菌沉淀，用30 ml 2×YTA (2×YT 液體培養(yǎng)基含100 μg/ml 氨芐青霉素)重懸細(xì)菌沉淀，加入約3×109TU 輔助噬菌體M13K07，37℃靜止感染15min，然后37℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)2 h。加入終濃度20 μg/ml 卡拉霉素后于32℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。次日用PEG/NaCl 溶液(20% PEG，2.5 mol/L NaCl)沉淀噬菌體，用1×PBS 緩沖液重懸抗體文庫噬菌體。

1.2.5 噬菌體 ELISA 包被液(0.1 mol/L NaHCO3/ Na2CO3溶液，pH9.6)將TSLP 純化蛋白稀釋為30 μg/ml，于酶標(biāo)板內(nèi)4℃包被過夜。次日封閉液(1×PBS 含5% 脫脂奶粉和0.05% Tween 20)37℃封閉酶標(biāo)孔1 h，1×PBST(1×PBS 含0.05%Tween 20)緩沖液洗滌酶標(biāo)孔。加入等體積封閉液室溫封閉30 min 的抗體文庫噬菌體溶液，37℃孵育1 h。洗滌酶標(biāo)孔后，加入抗M13 單克隆抗體37℃孵育1 h。洗滌酶標(biāo)孔后，加入馬抗鼠抗AP 標(biāo)記抗體37℃孵育1 h。最后用PNPP 顯色液顯色，于405 nm 處讀取吸光值(A)。

2 結(jié)果

2.1 TSLP 的擴增 公司合成TSLP cDNA 片段。采用設(shè)計的引物對TSLP cDNA 進(jìn)行PCR 擴增，得到擴增片段大小為423 bp，與目的基因大小一致，見圖1。經(jīng)測序和NCBI BLAST 比對，擴增的基因序列正確，為TSLP。

2.2 TSLP 的純化及鑒定 pET101/D-TOPO 融合表達(dá)載體攜帶有氨芐青霉素抗性基因，但是由于蛋白表達(dá)量比較低，所以選擇用羧芐青霉素作為抗性篩選對蛋白進(jìn)行表達(dá)。pET101/ D-TOPO 融合表達(dá)載體攜帶有6×His 標(biāo)簽，有利于目的蛋白的鑒定。表達(dá)后，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，表達(dá)的TSLP 蛋白大小為26 kD 左右。經(jīng)Ni-NTA 親和純化系統(tǒng)在變性條件下純化得到TSLP 蛋白(圖2)，并進(jìn)行Dot blot、Western blot 鑒定，證明表達(dá)純化的蛋白即為目的蛋白TSLP(圖3)。

2.3 抗TSLP 全人源單鏈抗體的篩選 用TSLP 生物素化蛋白作為抗原，采用免疫磁珠法對天然全人源scFv 抗體文庫進(jìn)行了3 輪噬菌體展示富集，從3輪富集后的scFv 抗體文庫中隨機挑取克隆子，進(jìn)行單克隆子噬菌體擴增表達(dá)，對表達(dá)的scFv 以抗M13單克隆抗體和馬抗鼠抗AP 標(biāo)記抗體進(jìn)行ELISA 檢測，結(jié)果顯示:經(jīng)3 輪富集后，特異性單鏈抗體得到富集。取富集后48 個克隆子進(jìn)行ELISA 檢測，其中取2 個作為陰性對照(不加入抗原)，結(jié)果顯示，陰性對照OD405值為0.05左右，大部分克隆子與抗原有結(jié)合反應(yīng)，而OD405＞0.8 的陽性單鏈抗體占35%左右(圖4)。

圖1 PCR 擴增TSLP cDNAFig.1 Amplification of cDNA of TSLP by PCR

圖2 SDS-PAGE 鑒定純化的TSLP 蛋白Fig.2 Purification and identification of TSLP by SDS-PAGE

圖3 Dot blot 和Western blot 鑒定表達(dá)的TSLP 蛋白Fig.3 Identification of expressive TSLP by Dot blot and Western blot

圖4 ELISA 篩選抗TSLP 單鏈抗體Fig.4 Selection of scFv against TSLP by ELISA

圖5 Dot blot 和Western blot 鑒定表達(dá)的抗TSLP 單鏈抗體Fig.5 Identification of expressive scFv against TSLP by Dot blot and Western blot

2.4 單鏈抗體的鑒定 通過ELISA 檢測，挑取與TSLP 抗原結(jié)合能力強的2 株單鏈抗體進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Dot blot、Western blot 鑒定，結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物在32 kD 處有單一條帶，為表達(dá)的單鏈抗體(圖5)。測序結(jié)果表明:序列為開放閱讀框，為linker (Ser4Gly)3連接的VH 和VL，測序的氨基酸序列見圖6。說明從天然全人源scFv 抗體文庫中成功的篩選到抗TSLP 全人源單鏈抗體，但從天然抗體文庫中篩選得到單鏈抗體其親和力相對較低，后期我們將對單鏈抗體親和力進(jìn)行進(jìn)化，針對抗TSLP單鏈抗體構(gòu)建突變抗體文庫，以篩選到高親和力的全人源抗TSLP 單鏈抗體。

圖6 測序鑒定的TSLP 單鏈抗體氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequence of selected scFv against

3 討論

TSLP 優(yōu)先表達(dá)于肺、腸、皮膚等部位的上皮細(xì)胞，當(dāng)過敏性炎癥發(fā)生時，上皮細(xì)胞受抗原刺激上調(diào)表達(dá)TSLP，并在局部激活DC 細(xì)胞分化，釋放趨化因子，活化成熟的DC 細(xì)胞遷移至淋巴結(jié)，促使CD4+T 細(xì)胞分化并產(chǎn)生Th2 型細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子進(jìn)一步放大免疫反應(yīng)［9，10］。這些研究強調(diào)了TSLP 在Th2 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的重要性，因此TSLP 靶標(biāo)的治療為過敏性炎癥疾病提供新手段［11］。體外實驗發(fā)現(xiàn)，TSLP 轉(zhuǎn)基因鼠易受特異性抗原誘導(dǎo)而發(fā)生哮喘，而TSLP 受體敲除的小鼠癥狀明顯減輕，說明TSLP 對于氣道過敏反應(yīng)的發(fā)生是必需的［12］。因此針對TSLP 制備中和性抗體成為研究熱點，李艷紅等［13］體外實驗中使用中和性TSLP 抗體對致敏小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Th2 型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5 和IL-13)明顯減少，這說明阻斷TSLP可以抑制DC 活化和Th2 型炎癥的產(chǎn)生。

本研究中制備的單鏈抗體為全人源天然抗體文庫篩選得到，全人源單鏈抗體相對于鼠源型、人源化抗體特異性更強，排斥性更小。目前國內(nèi)外均未見抗TSLP 全人源抗體的問世。本實驗后期將對篩選得到的TSLP 單鏈抗體進(jìn)行親和力進(jìn)化，構(gòu)建抗TSLP 突變文庫，篩選得到親和力和特異性更高的抗TSLP 單鏈抗體，為過敏性炎癥反應(yīng)尋找效果更好的治療途徑。

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