人外周血NK 細胞及NKT 細胞受體及亞群的差異表達與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

麥迪娜·麥麥提明 姜振宇 葉 壯 張 進 趙 令 劉 濤

(新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830011)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以致殘性多關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的、對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病。本病的核心是自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的損傷和人體的自我修復(fù)［1，2］。最近的一些研究對NK 和NKT 細胞及其亞群進行了一些描述，但對于RA 發(fā)病初期這些細胞的狀態(tài)及功能的了解卻很少。

NK(CD3-CD56+)細胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，并在固有和獲得性免疫中均發(fā)揮著重要作用。這些細胞不僅有直接殺傷靶細胞的能力，還可以與抗原提呈細胞(APC)及T 細胞相互作用［3，4］。NKT 細胞是一群細胞表面既有T 細胞受體(TCR)，又有NK 細胞活化受體的特殊T 細胞亞群。NKT 細胞可以通過表面的CD1d 分子識別B 細胞呈遞的糖脂抗原，從而引起NKT 細胞激活。NKT 細胞在很多病理條件下發(fā)揮作用，并在自身免疫性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用［5］。NK 細胞和NKT 細胞的功能是受多樣化的表面受體的不同組合而產(chǎn)生活化和抑制信號之間的微妙平衡調(diào)控的。在正常人體內(nèi)，抑制性信號在NK 細胞內(nèi)占主導(dǎo)作用，抑制性受體識別自身組織細胞表面HLA-Ⅰ類分子后，可啟動抑制性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而活化性受體的功能受到抑制，進而NK 細胞和NKT 細胞不能殺傷自身正常組織細胞。這些受體包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)，如KIR2DL3、KIR3DL1 和CD94/NKG2A 異二聚體受體。另外，這些細胞具有活化受體，包括NKG2C、NKG2D 以及天然的細胞毒性受體NKp30、NKp44 和NKp46［6］。已有較多的研究發(fā)現(xiàn)NK 細胞在RA 發(fā)病中具有重要作用［7，8］。但初診RA 患者NK 和NKT 細胞的受體及亞群頻率的變化，以及NK和NKT 細胞與初診RA 患者疾病活動度之間的關(guān)系尚未被開發(fā)研究。因此，我們設(shè)計了本項研究，了解不同的NK 和NKT 細胞比例，以及通過NK 細胞的直接細胞毒性作用和細胞因子的分泌，了解初診RA 患者外周血NK 及NKT 細胞受體及亞群的差異表達和RA 之間的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 32 例RA 患者皆為吉林大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院患者。在我院體檢中心選取15 例種族、性別、年齡相匹配的健康志愿者作為健康對照組，所有的RA 患者均符合2010 年ACR/EULAR 提出的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷標準［9］。疾病活動度的程度是由DAS28 指數(shù)評估，其中評分＞3.2分被定義為活動性RA。患者既往未應(yīng)用任何相關(guān)藥物治療?；颊叩奶卣饕姳?。本項研究以赫爾辛基宣言的指導(dǎo)方針，并通過吉林大學(xué)人類倫理委員會批準。每個參與者均簽署知情同意書。

1.2 臨床指標測定 每名入組對象的臨床指標及數(shù)據(jù)均從醫(yī)院調(diào)取，包括性別、年齡及當前用藥。所有研究樣本的常規(guī)實驗室檢查包括全血細胞計數(shù)、血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)，類風(fēng)濕因子(RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽(抗CCP)抗體的測定采用散射比濁法，應(yīng)用西門子特種蛋白分析儀。DAS28 評分由經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師計算。

1.3 實驗儀器 FACS Calibur 型流式細胞儀(美國BD 公 司)、CO2培 養(yǎng) 箱(Thermo)、離 心 機(Eppendorf)、微量加樣器(法國GLISON 公司)、渦旋振蕩器(其林貝爾)、生物安全柜(青島海爾)、熒光顯微鏡(日本Olympus)、高壓滅菌器(山東新華醫(yī)療器械有限公司)、4℃冰箱(青島海爾)、-20℃冰箱(青島海爾)、Eppendorf 紫外分光光度計(德國Bio-Photometer)、10 ml 肝素鈉抗凝管(武漢致遠醫(yī)療科技有限公司)、電子天平(上海上天精密儀器有限公司)、10 μl、200 μl 和1 000 μl 吸頭(江蘇海門塑料廠)、10 ml 離心管(江蘇海門塑料廠)、1.5 ml EP管(江蘇海門塑料廠)。

1.4 實驗試劑 FITC 標記的CD3 單克隆抗體、APC 標記的CD56 單克隆抗體、PerCP 標記的CD16單克隆抗體、PE 標記的NKG2D 單克隆抗體、NKG2C 單克隆抗體、NKp30 單克隆抗體、NKp44 單克隆抗體、NKp46 單克隆抗體、NKG2A 單克隆抗體、KIR2DL3 單克隆抗體、KIR3DL1 單克隆抗體、CD158a 單克隆抗體、CD158b 單克隆抗體(美國BD公司)，100×PBS，RPMI1640 培養(yǎng)基(長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，淋巴細胞分離液(中國科學(xué)院生物工程研究所-灝洋生物)，固定劑A 和破膜劑B(美國Andergrub 公司)，1%的多聚甲醛(天津市華東試劑廠)，0.1 mg/ml 的佛波酯(PMA)(Calbionchem 公司)，0.05 mg/ml 藍菌素A(BFA)(美國Sigma 公司)，0.5 mg/ml 依諾霉素(Iono，美國Sigma公司)，2%的FACS 細胞裂解液(美國BD 公司)。

表1 研究參與者的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床指標Tab.1 Demographics and clinical indexes of study participants

1.5 操作方法

1.5.1 外周血單個核細胞(PBMC)分離及培養(yǎng)取新鮮外周血樣，離心(1 500 r/min×5 min)去除血漿，離心(1 700 r/min×30 min)后吸中間白膜層，即為PBMC，加入適量PBS 洗滌2 遍(1 800 r/min×15 min)，去上清后加入400 μl RPMI1640，計數(shù)后按1.0×107ml-1重懸細胞備用，孵育板中選取兩個孔標記為對照孔和刺激孔，分別裝入100 ml 細胞混懸液，放入恒溫箱孵育6 h，分別在0 h 使向刺激孔中加入0.1 mg/ml PMA 30 μl、0.5 mg/ml Iono 2 μl，對照孔加入32 μl PBS，在2 h 時向刺激孔中加入0.05 mg/ml BFA 2 μl，對照孔加入2 μl PBS。

1.5.2 IFN-γ 的流式鑒定 去除孵育6 h 的孵育板，吸取細胞混懸液至兩個流式管中，分別標記對照管和刺激管，均加入適量PBS 洗滌1 遍(1 200 r/min×5 min)后去上清，兩管均加入熒光標記的anti-CD3-FITC、anti-CD56-APC、anti-CD16-PerCP 4 μl，避光封閉30 min，加入固定劑A 50 μl，再避光封閉30 min，加入適量PBS 洗滌1 遍(1 200 r/min×10 min)，去上清后加入破膜劑B 50 μl，熒光標記的抗體anti-IFN -PE 1 μl，流式細胞儀檢測CD3-CD56+IFN-γ，通過Flowjo(v7.6.2)軟件分析。

1.5.3 NK 細胞及其受體的檢測 每個采集管采集50 μl 血液，均加入5 μl anti-CD3-FITC、anti-CD56-APC、anti-CD16-PerCP，然后分別加入5 μl 單克隆抗體，包括anti-NKG2C-PE、anti-NKG2D-PE、anti-NKp30-PE、anti-NKp44-PE、anti-NKp46-PE、anti-NKG2A-PE、anti-KIR2DL3-PE、anti-KIR3DL1-PE、anti-CD158a-PE、anti-CD158b-PE。陰性對照加入相同的熒光標記的同種免疫球蛋白。樣本在室溫下放置20～30 min，之后加入FACS 細胞裂解液，靜置6 min。用PBS 震蕩混勻，1 200 r/min×10 min 洗滌2 遍后，用流式細胞儀進行檢測，使用Flowjov7.6.(4)軟件分析NKG2C+CD3-CD56+、NKG2D+CD3-CD56+、NKP30+CD3-CD56+、NKP46+CD3-CD56+、KIR2DL3+CD3-CD56+、KIR3DL1+CD3-CD56+、NKG2A+CD3-CD56+、CD158a+CD3-CD56+和CD158b+CD3-CD56+的比率。

1.6 NK 細胞的脫顆粒 從上述個體的血液樣品進行外周血單核細胞(PBMC)純化。簡言之，將PBMC(＞106個細胞/孔)中共培養(yǎng)K562 的細胞以10 ∶1的效應(yīng)器與靶的比率(E ∶T)RPMI1640 培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在37℃中培養(yǎng)，在5%CO2抗CD107a mAb(H4A3，流式細胞Dickinson公司)存在下，進行5 h 監(jiān)測脫粒。重復(fù)地用PBS 單獨培養(yǎng)的PBMC 作為陰性對照。此后，分別將之前所述的所有細胞用FITC-抗-CD3 和APC-抗CD56標記，幾次洗滌后用PBS 將樣品用流式細胞儀緩沖液并貯存于4℃直至分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 所有的數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)和范圍，除非另有指明。組間比較均致力于以Mann-Whitney U 檢驗。兩個變量之間的相關(guān)性都采用SPSS14.0 軟件(SPSS 公司，芝加哥，IL)Spearman 秩相關(guān)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 初診RA 患者外周血NK 細胞的比例和抑制性、活化性NK 細胞亞群比例 本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，初診RA 患者外周血NK 細胞的比例明顯較低(P=0.026)。活化的NK 細胞亞群NKG2D+和NKP46+的比例較對照組顯著增高(P=0.011，P=0.010)。相比之下，抑制性NK 細胞KIR2DL3+，KIR3DL1+和NKG2A+在初診RA 患者外周血所占的比例均較對照組顯著降低(P=0.002，P=0.002，P=0.014)。

2.2 初診RA 患者外周血中活化性、抑制性NKT細胞亞群頻率 至于NKT 細胞，在初診RA 患者中未得到類似NK 細胞的結(jié)果。與健康對照組比較中，外周血NKT 細胞的頻率沒有顯著改變。然而，活化性NKT 細胞NKG2C+，NKG2D+，NKP46+的比例在RA 患者外周血中均顯著增高(P ＜0.001，P=0.032，P=0.001)。相比之下，抑制性NKT 細胞中的KIR2DL3+和NKG2A+在RA 患者外周血中的比例均顯著降低(P=0.027，P=0.002)。

2.3 活化的NK 細胞、NKT 細胞分泌的IFN-γ+在RA 患者中出現(xiàn)頻率 RA 患者和健康對照組中極少有NK 和NKT 細胞自發(fā)產(chǎn)生的IFN-γ，隨后通過PMA 和IONO 并孵育后，可見刺激的NK 細胞IFNγ+在初診RA 患者中的頻率較對照組顯著增高，相同的差異存在于誘導(dǎo)后的NKT 細胞分泌的IFN-α頻率在RA 患者和對照組之間。

2.4 初診RA 患者外周血中自發(fā)性的以及刺激CD107a+NK 細胞頻率 自發(fā)的CD107a+NK 細胞在RA 患者中的頻率顯著高于健康對照組。同樣的結(jié)果在受刺激的CD107a+NK 細胞中也可見。

2.5 初診RA 患者外周血中NK 細胞、抑制性NK細胞NKG2A+、KIR2DL3+的比例與DAS28 評分相關(guān) 初診RA 患者外周血中NK 細胞、抑制性NK 細胞NKG2A+、KIR2DL3+與DAS28 的值顯著相關(guān)(r=0.357，P=0.045;r=0.399，P=0.024;r=0.468，P=0.021)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，初診的RA 患者外周血中某些細胞，如NK 細胞和NKT 細胞及其受體、亞群所占的比例與健康對照組相比存在顯著差異。

NK 細胞，作為固有免疫系統(tǒng)的組成部分，是最重要的細胞之一，其對感染和腫瘤細胞具有直接殺傷作用。但是最近，在研究NK 細胞和其他免疫細胞之間的相互作用時，認為NK 細胞在許多自身免疫性疾病中具有免疫和非免疫細胞的作用［10］。NKT 細胞是淋巴細胞與T 和NK 細胞功能的獨特子群，作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，它們能夠迅速地產(chǎn)生大量的細胞因子，如IFN-γ 和IL-4，與T 細胞受體相應(yīng)的結(jié)合?；罨腘KT 細胞也可刺激多種固有免疫和適應(yīng)性免疫。NKT 細胞在人體中的作用尚不清楚，但目前普遍認為它們具有免疫抑制活性和/或可以促進增強細胞免疫介導(dǎo)的功能［11］。已有報道，NKT 細胞在廣泛的疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括抗腫瘤反應(yīng)、自身免疫、宿主防御、過敏和炎癥反應(yīng)［12］。

在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在初診RA 患者外周血中NK 細胞的比例較正常對照組顯著降低，這與相關(guān)研究一致［13，14］。一些研究表明細胞因子(IL-18、IL-15、IL-12 和TNF-α)誘導(dǎo)NK 細胞死亡是解釋在RA 患者血清中NK 細胞數(shù)量低的原因之一。此外，還有以前的報告顯示，IL-6 可能通過細胞凋亡過程誘導(dǎo)NK 細胞耗竭［15］。本研究表明NK 細胞在外周血中的耗盡可能在RA 的發(fā)病過程中起一定的作用。同時，我們發(fā)現(xiàn)NK 細胞活化性受體NKG2D+，NKP46+和NKT 細胞活化性受體NKG2C+NKG2D+，NKP46+在初診的RA 患者外周血中的比例較健康對照組顯著增高。與此相反，NK 細胞抑制性受體KIR2DL3+，KIR3DL1+和NKG2A+和NKT 細胞抑制性受體KIR2DL3+，NKG2A+在初診的RA 患者外周血中的比例顯著降低。正如我們在初診的RA 患者外周血中的NK 細胞和NKT 細胞及其亞群變化的研究所示，我們發(fā)現(xiàn)RA 患者NK 細胞和NKT 細胞的抑制作用逐漸變?nèi)酰罨Ч饾u變強。所有的變化導(dǎo)致NK 細胞和NKT 細胞的活化，從而導(dǎo)致NK 細胞對正常細胞的殺滅作用增強，這意味著自身免疫性疾病的發(fā)生。我們的研究結(jié)果與Cheema等［16］報道的RA 患者NK 細胞頻率較低是一致的。但我們的結(jié)果與他們的NKG2A 在CD3-CD56+NK細胞頻率較高是完全不同的。Walsh 等［17］也支持Cheema 等［16］在NKG2A 的結(jié)果［36］。在他們看來，NK 細胞抑制性受體NKG2A 高表達，阻斷細胞毒性作用，從而影響NK 細胞的存活。這抑制性受體也被認為是防止NK 細胞介導(dǎo)的反應(yīng)對抗正常細胞或者可能有助于防止T-細胞介導(dǎo)的自身反應(yīng)和抵消活化性受體NKG2D 和NKG2C 的作用［18］。這種差異可能是因為研究的人群不同，他們研究的患者用了一段時間藥物治療，而不是我們研究的新發(fā)病的RA 患者。對于NK 細胞和NKT 細胞在RA 的進一步功能，需要更多的研究。

我們的研究還表明，RA 患者的NK 細胞和NKT細胞分泌高水平的IFN-γ。正如我們所知，這種細胞因子能促進Th1 細胞極化，從而介導(dǎo)細胞免疫［19］。并且可以增強特異性細胞毒性通過Ⅰ類和Ⅱ類MHC 分子的表達［20］，更重要的是，IFN-γ 可以提高B 細胞活化，促進抗原加工［21］。在NK 細胞活性分析的部分，與健康對照組相比，初診的RA 患者外周血中NK 細胞表現(xiàn)出增長的通過K562 細胞誘導(dǎo)的細胞毒性作用。人們相信，盡管初診的RA 患者的NK 細胞比例下降，NK 細胞仍可釋放足夠的穿孔素和蛋白酶等酶脫粒。

在我們的研究中后期，我們對NK 細胞、抑制性NKT 細胞亞群與初診RA 患者的臨床指標之間的潛在關(guān)系的分析中發(fā)現(xiàn)，初診RA 患者的NK 細胞，抑制NKT 細胞NKG2A+和KIR2DL3+頻率與DAS28 評分結(jié)果值顯著相關(guān)相關(guān)。有人認為，淋巴細胞亞群的比例可能同DAS28 值一樣，可以有效地評估RA的疾病活動度。但這需要更多的對照試驗來驗證這些結(jié)果。

總而言之，我們的研究結(jié)果表明，免疫細胞亞群的改變(NK 細胞的降低，NKG2D+的增加，活化性NK 細胞受體NKP46+和NKG2C+NKG2D+，活化性NKT 細胞受體NKP46+，KIR2DL3+，抑制性NK 細胞受體KIR3DL1+和NKG2A+的減少和抑制性NKT 細胞受體KIR2DL3+NKG2A+，活化后NK 細胞分泌的IFN-α+NK 細胞的增加，都自發(fā)的和活化的CD107a+NK 細胞的增加)在RA 的發(fā)病機制中可能扮演了一個重要的角色。淋巴細胞亞群及DAS28 之間的顯著相關(guān)性表明，淋巴細胞亞群臨床上可能可以反映RA 患者的疾病活動度?？傊?，闡明NK 和NKT 細胞參與RA 的機制需要更多的研究。

［1］Guo Ying ying，Wang Nai zhi，Zhao Shuai，et al.Increased interleukin-23 is associated with increased disease activity in patients with rheumatoid arthritis［J］.Chin Med，2013，126(51):850-854.

［2］Widdifield J.The epidemiology of rheumatoid arthritis (RA)in Ontario，Canada［J］.Arthritis Rheum，2014，66(6):786-793.

［3］Saman Ahmad，Safia Habib，Moinuddin N，et al.Preferential recognition of epitopes on AGE-IgG by the autoantibodies in rheumatoid arthritis patients［J］.Hum Immunol，2013，74(1):23-27.

［4］Biró A，Tompa A.The effect of Kaqun-water on the immune parameters of healthy volunteers［J］Hungarian，2014，155 (24):949-953.

［5］Ahern DJ，Brennan FM.The role of natural killer cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis:major contributors or essential homeostatic modulators ［J］.Immunol Lett，2011，136 (2):1115-1121.

［6］Di Santo JP.Functionally distinct NK-cell subsets:developmental origins and biological implications［J］.Eur J Immunol，2008，38(11):2948-2951.

［7］Richter J，Benson V，Grobarova V，et al.CD161 Receptor participates in both impairing NK cell cytotoxicity and the response to glycans and vimentin in patients with rheumatoid arthritis［J］.Clin Immunol，2010，136:139-147.

［8］Van der Helm-van Mil AH，Huizinga TW.The，2010 ACR/EULAR criteria for rheumatoid arthritis:do they affect the classification or diagnosis of rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2012，71(10):1596-1598.

［9］Smyth MJ，Godfrey DI.NKT cells and tumor immunity—a doubleedged sword［J］.Nat Immunol，2000，22(1):459-460，22.

［10］Godfrey DI，Kronenberg M.Going both ways:immune regulation via CD1d-dependent NKT cells［J］.Clin Invest，2004，24(114):1379-1388.

［11］Shibatomi K，Ida H，Yamasaki S，et al.A novel role for interleukin-18 in human natural killer cell death:high serum levels and low natural killer cell numbers in patients with systemic autoimmune diseases［J］.Arthritis Rheum，2001，44:884-892.

［12］Park YW，Kee SJ，Cho YN，et al.Impaired differentiation and cytotoxicity of natural killer cells in systemic lupus erythematosus［J］.Arthritis Rheum，2009，60:1753-1763.

［13］Steimle V，Siegrist CA，Mottet A，et al.Regulation of MHC classⅡexpression by interferon-γ mediated by the transactivator gene CIITA［J］.Science，1994，265:106-109.

［14］Sijts A，Sun Y，Janek K，et al.The role of the proteasome activator PA28 in MHC class Ⅰantigen processing［J］.Mol Immunol，2002，39:165-169.

［15］Zhang J，Roschke V，Baker KP et al.Cutting edge:a role for B lymphocyte stimulator in SLE［J］.Immunol，2001，166:6-10.

［16］Cheema GS，Roschke V，Hilbert DM，et al.Elevated serum B lymphocyte stimulator levels in patients with systemic immune based rheumatic diseases［J］.Arthritis Rheum，2001，44:1313-1319.

［17］Walsh CE，Ryan EJ，O’Farrelly C，et al.Differential expression of NK receptors CD94 and NKG2A by T cells in rheumatoid arthritis patients in remission compared to active disease［J］.Plos One，2011，6(11):e27182.

［18］McMahon CW，Raulet DH.Expression and function of NK cell receptors in CD8(+)T cells［J］.Curr Opin Immunol，2001，13:465-470.

［19］Martin-Fontecha A，Thomsen LL，Brett S，et al.Induced recruitment of NK cells to lymphnodes provides IFN-γ for TH1 priming［J］.Nat Immunol，2004，5:1260-1265.

［20］Aramaki T，Ida H，Izumi Y，et al.A signficantly impaired natural killer cell activity due to a low activity on a per-cell basis in rheumatoid arthritis［J］.Mod Rheumatol，2009，19:245-252.

［21］Izumi Y，Ida H，Huang M，et al.Characterization of peripheral natural killer cells in primary Sjo¨gren’s syndrome:impaired NK cell activity and low NK cell number［J］.Lab Clin Med，2006，147:242-249.