魏 穎，劉 華，陳麗麗，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，胡火根

（1.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013；2.江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046）

0 引言

目前我國的克氏原螯蝦以出口為主，而出口產(chǎn)品主要以蝦仁的形式，因此在對(duì)蝦的加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的蝦頭、蝦殼等下腳料 (占整蝦的30%～40%)[1].這些副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)、蝦紅素、不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-3]，同時(shí)含有各種氨基酸以及人體必需的微量元素[4].蝦頭、蝦殼是一種優(yōu)質(zhì)的可再利用的資源，但長(zhǎng)期以來，我國對(duì)這部分資源沒有進(jìn)行有效的利用，除少量被用于生產(chǎn)肥料、飼料和制備幾丁質(zhì)之外，大部分被作為垃圾丟掉，這樣不僅使資源嚴(yán)重浪費(fèi)，而且也會(huì)造成環(huán)境污染.

鈣是人體內(nèi)必需的元素之一，它是組成人體骨骼、牙齒、臟器和肌肉組織的重要成分[5].當(dāng)人體中鈣缺乏時(shí)，會(huì)發(fā)生各種生理功能障礙，如失眠、疲勞、抽筋、骨痛等.蝦殼中的鈣是一種天然綠色的鈣源.張祥剛等[6]對(duì)南美白對(duì)蝦蝦殼（干重）進(jìn)行礦物元素含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其中鈣元素含量約占總金屬元素含量的92.06%.但蝦殼中的鈣主要以不易被人體吸收利用的碳酸鈣形式存在.本研究目的就是尋求一種能直接提取的方法替代以往的高溫鍛燒法，將蝦殼中的無機(jī)碳酸鈣轉(zhuǎn)化成易于被人體吸收利用的具有含鈣量高、易溶解、吸收快、安全性好、價(jià)格合理等優(yōu)點(diǎn)[7]的乳酸鈣，使其作為一種安全的添加劑、穩(wěn)定劑、營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑和組織凝固劑等[8]，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)中[9]，為科學(xué)地開發(fā)蝦殼資源提供一條有效的技術(shù)途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦殼：江西海浩鄱陽湖水產(chǎn)有限公司.

乳酸、氨水、氯化銨、三乙醇胺、乙二胺基四乙酸二鈉（EDTA）、鉻黑T、氯化鈣、鹽酸、氯化銨、氨水、氫氧化鈉等均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；粉碎機(jī)：上海比朗儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司.

1.3 蝦殼預(yù)處理

蝦殼預(yù)處理：用4%的氫氧化鈉溶液浸泡蝦殼4 h，用水洗至中性，重復(fù)1 次.將經(jīng)過初分的蝦殼置于100 ℃的鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥12 h.再將干燥好的蝦殼粉碎，過40 目篩，貯存?zhèn)溆?

1.4 鈣含量的分析[10]

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取已恒質(zhì)量的無水氯化鈣2.774 6 g，用蒸餾水定容至250 mL 配成0.1 mol/L 的氯化鈣溶液，此時(shí)鈣離子的濃度為4 mg/mL.

鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：分別取1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 的氯化鈣溶液于50 mL 的三角瓶中，均用蒸餾水定容至總體積為10 mL.分別在待測(cè)溶液中加入3 mL 的三乙醇胺溶液，5 mL pH 10的氨性溶液和兩滴鉻黑T 指示劑，然后以0.021 5 mol/L 的EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到溶液由紫藍(lán)色變成藍(lán)色.以EDTA 滴定體積和鈣濃度作圖，得到鈣標(biāo)準(zhǔn)曲線.通過實(shí)驗(yàn)計(jì)算鈣的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2.978 6x+0.590 5（y 代表EDTA 的滴定體積，x 代表鈣離子濃度，R2=0.998）.

蝦殼浸酸溶液中鈣含量的測(cè)定：取1 mL 浸酸溶液加9 mL 蒸餾水，分別加入3 mL 三乙醇胺和5 mL 氨性溶液，兩滴鉻黑T 指示劑，以標(biāo)準(zhǔn)EDTA溶液滴定到溶液由紫藍(lán)色轉(zhuǎn)為藍(lán)色.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算浸酸溶液中鈣含量.

1.5 單因素試驗(yàn)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]中的測(cè)定方法略作修改.

（1）乳酸添加量的確定：蝦殼粉用量為10 g，加水量為100 mL，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為35℃，乳酸添加量分別為13.5 mL、16.0 mL、18.5 mL、21.0 mL、23.5 mL.待反應(yīng)結(jié)束后，分別測(cè)定浸提液中鈣的含量.

負(fù)面清單模式能夠極大地賦予市場(chǎng)主體從事經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的自由，這可能會(huì)造成社會(huì)資本流向熱點(diǎn)行業(yè)、熱點(diǎn)地區(qū)，導(dǎo)致行業(yè)發(fā)展不平衡，地區(qū)發(fā)展不均衡。適當(dāng)?shù)墓苤瓶梢砸龑?dǎo)市場(chǎng)主體的行為，避免市場(chǎng)主體之間的惡性競(jìng)爭(zhēng)，更合理、有效地配置社會(huì)資源，促進(jìn)行業(yè)和地區(qū)經(jīng)濟(jì)的均衡發(fā)展，防止壟斷的發(fā)生。

（2）提取溫度的確定：蝦殼粉用量為10 g，加水量為100 mL，提取時(shí)間為2 h，乳酸添加量為（1）試驗(yàn)中較適宜的結(jié)果，提取溫度分別為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃.待反應(yīng)結(jié)束后，分別測(cè)定浸提液中鈣的含量.

（3）提取時(shí)間的確定：蝦殼粉用量為10 g，加水量為l00 mL，乳酸添加量和提取溫度分別采用（1）和（2）試驗(yàn)中較適宜的結(jié)果，提取時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min.待反應(yīng)結(jié)束后，分別測(cè)定浸提液中鈣的含量.

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝試驗(yàn)[12-15]

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用乳酸添加量、提取時(shí)間、提取溫度3 個(gè)因素與鈣提取量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化蝦殼鈣提取工藝.通過Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)最優(yōu)的工藝參數(shù).在分析得到的最佳工藝提取條件下，做3 組平行試驗(yàn)驗(yàn)證響應(yīng)面分析法的可靠性.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乳酸添加量對(duì)蝦殼鈣提取量的影響（圖1）

圖1 乳酸添加量對(duì)蝦殼鈣提取量的影響

由圖1 可以看出，在乳酸添加量達(dá)到21 mL之前，鈣的提取量隨著乳酸的體積增加而增加并達(dá)到最大值，之后又隨著乳酸添加量的增加而減少.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是乳酸添加量為21 mL 時(shí)，轉(zhuǎn)化制取的乳酸鈣的產(chǎn)率和含量已經(jīng)達(dá)到了一種平衡的飽和狀態(tài)，處在具有較好產(chǎn)率的范圍內(nèi).但是當(dāng)乳酸添加量繼續(xù)增加時(shí)，乳酸鈣的產(chǎn)率減少，主要是因?yàn)楫?dāng)乳酸過量時(shí)會(huì)在反應(yīng)時(shí)形成乳酸酐，并吸附在乳酸鈣表面上，使其鈣的含量降低.因此，21 mL 乳酸添加量最佳.

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)蝦殼鈣提取量的影響（圖2）

圖2 提取溫度對(duì)蝦殼鈣提取量的影響

由圖2 可知，在25～55 ℃范圍內(nèi)，蝦殼鈣提取量隨著溫度的升高而增加，繼續(xù)升高溫度鈣提取量下降.這主要是由于溫度的升高可以增加大分子間的碰撞幾率，使得反應(yīng)向乳酸鈣生成的方向進(jìn)行，但是隨著溫度的不斷升高，乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成乳醛乳酸，并與鈣離子結(jié)合生成對(duì)應(yīng)的鈣鹽，導(dǎo)致生成的乳酸鈣含量逐漸下降[16].由此可知，最佳提取溫度是55 ℃.

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蝦殼鈣提取量的影響

由圖3 可以看出，在提取30 min 之內(nèi)，鈣提取量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，主要是由于在反應(yīng)剛開始時(shí)，系統(tǒng)中存在較多的乳酸和蝦殼，在這時(shí)系統(tǒng)中生成乳酸鈣的濃度比較小，其正反應(yīng)速率大于逆反應(yīng)速率，促使反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，即生成乳酸鈣的方向.在20～30 min 時(shí)間內(nèi)，由于正反應(yīng)速率在逐漸減小，使得乳酸鈣的增長(zhǎng)速率緩慢.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min 后曲線逐漸趨于平緩，表明系統(tǒng)中的反應(yīng)已經(jīng)趨于平衡，隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)增加，反應(yīng)體系中逆反應(yīng)的發(fā)生幾率增加，曲線有下降的趨勢(shì).因此，蝦殼中鈣提取最佳時(shí)間為30 min.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)3 因素3 水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2.

表1 蝦殼鈣提取工藝Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素、水平及編碼

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及鈣的提取量的測(cè)定結(jié)果

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 8.0.6 對(duì)表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合得到提取量（Y）對(duì)時(shí)間（A）、乳酸添加量（B）、溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程模型如下：

觀察回歸方程可以看出蝦殼中乳酸鈣提取影響因素的大小順序?yàn)椋簻囟龋緯r(shí)間＞乳酸添加量.由表3 可知，模型的F=8.77，P＜0.01，說明本試驗(yàn)所采用的二次模型是顯著的.比較表3 中的P 值可知，C 極顯著，BC 交互項(xiàng)顯著.二次項(xiàng)B2、C2都極顯著表明各影響因素對(duì)提取量不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.

表3 鈣提取量回歸模型的方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析（圖4）

圖4 各因素對(duì)蝦殼鈣提取量的響應(yīng)面圖

響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化圖形為響應(yīng)Y 與對(duì)應(yīng)的因素間構(gòu)成的三維圖及在二維平面上的等高圖，綜合直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析，另外一個(gè)因素固定在零水平上.由圖4 可知，響應(yīng)面開口向下，隨著每個(gè)因素的值的增大，與其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值增大，然而當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大響應(yīng)值隨之減小.該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值.等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反.從其等高線圖可以直觀地看出時(shí)間和乳酸添加量、時(shí)間和溫度、溫度和乳酸添加量這3 組的兩因素交互作用顯著.從圖4 可以看出，3 因素的交互作用均有最大值，說明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)能夠較好地反映出試驗(yàn)所設(shè)定的3 因素對(duì)鈣提取量的影響.

2.2.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證

由上述軟件分析得到最大的響應(yīng)值為765.12 mg，即每10 g 蝦殼中最大的鈣提取量為765.12 mg，與之對(duì)應(yīng)的最佳工藝條件為：乳酸添加量21.43 mL、溫度61.34 ℃、時(shí)間40 min.根據(jù)實(shí)際操作，對(duì)工藝條件進(jìn)行簡(jiǎn)化處理，在乳酸添加量21.43 mL、溫度61 ℃、時(shí)間40 min 條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過3 組平行試驗(yàn)所得到的每10 g 蝦殼鈣的提取量分別為760.29 mg、765.08 mg 和762.07 mg.平均值為762.48 mg，與模型的預(yù)測(cè)值765.12 mg基本相符.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了用乳酸提取法從克氏原螯蝦蝦殼中提取乳酸鈣的最佳工藝條件：10 g 蝦殼粉，100 mL 水，乳酸添加量為21.43 mL，溫度61.34 ℃，時(shí)間40 min，此條件下的鈣提取量為762.48 mg.

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