電噴霧離子化質(zhì)譜在巖藻聚糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

胡 培，吳 斌，李志雄*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 曙光臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

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電噴霧離子化質(zhì)譜在巖藻聚糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

胡 培1,2，吳 斌2，李志雄2*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 曙光臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

綜述了電噴霧離子化質(zhì)譜的電離原理和多糖的電噴霧電離機(jī)理，以及電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)在巖藻聚糖結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用。

電噴霧電離質(zhì)譜；巖藻聚糖；結(jié)構(gòu)解析；綜述

近年來，隨著對多糖生物大分子的深入研究，多糖的許多重要生物活性引起了越來越多的學(xué)者關(guān)注，在高活性多糖的新藥開發(fā)及其生物學(xué)構(gòu)效關(guān)系研究中，闡明多糖的具體結(jié)構(gòu)具有至關(guān)重要的意義。多糖結(jié)構(gòu)的分析較蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析復(fù)雜，因?yàn)榻M成多糖的單糖種類多，連接方式不同及連接有分支，因而需要將各種化學(xué)及物理方法結(jié)合起來才能完成對多糖結(jié)構(gòu)的分析。多糖結(jié)構(gòu)分析中，質(zhì)譜由于具有高靈敏性及高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為結(jié)構(gòu)分析中的一種主要分析手段。尤其是各種軟電離技術(shù)在多糖中的應(yīng)用[1-2]，如快原子轟擊質(zhì)譜[3]、電噴霧質(zhì)譜[4]、基質(zhì)輔助激光解吸離子化[5]等飛行時(shí)間質(zhì)譜，使多糖結(jié)構(gòu)的研究取得了日新月異的進(jìn)展。本文主要綜述電噴霧離子化質(zhì)譜(ESIMS)技術(shù)在巖藻聚糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用。

1 電噴霧電離質(zhì)譜

1.1 電噴霧電離技術(shù)

電噴霧電離是現(xiàn)代質(zhì)譜中的軟電離技術(shù)，是將溶液中分子轉(zhuǎn)變成氣相分子非常有用的手段[6]，其電離的過程主要分為三個(gè)階段：液滴的形成、液滴蒸發(fā)和氣態(tài)離子的形成。樣品溶液通過毛細(xì)管導(dǎo)入大氣壓電離源內(nèi)，在毛細(xì)管的出口處施加高電壓，使得樣品溶液在強(qiáng)電場及霧化氣的作用下形成細(xì)小的帶點(diǎn)液滴。細(xì)小的帶電液滴在高溫干燥氣流下，溶劑不斷蒸發(fā)，液滴直徑快速變小，比表面電荷不斷增加，然后達(dá)到瑞利極限后，發(fā)生庫侖爆炸，生成更小的帶電小液滴，此過程不斷地進(jìn)行(如圖1)，直至溶劑蒸發(fā)完全形成待測物離子[7-14]。

圖1 電噴霧電離過程

1.2 多糖在電噴霧中的電離機(jī)理

研究表明，多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子的電噴霧電離機(jī)理主要為帶電殘基模型[15]，首先由噴針外加電場使溶液帶電，形成帶電液滴，然后在電場的作用下加速運(yùn)動(dòng)并迅速去除溶劑，溶液中的分子所帶電荷被保留在溶質(zhì)分子上，形成離子化分子后進(jìn)入質(zhì)譜檢測器中檢測。

2 巖藻聚糖質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析

2.1 巖藻聚糖

巖藻聚糖是硫酸化的雜多糖，主要由巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸等單糖組成，其中各種糖環(huán)上有硫酸基團(tuán)的取代[16]。由于其無毒，具有廣泛的生物活性，逐漸成為研究的熱點(diǎn)，其活性主要包括免疫調(diào)節(jié)[17]、抗凝血作用[18]、抗病毒作用[19]、抗氧化活性[20]及抗腫瘤活性[21]。然而這些活性與巖藻聚糖的結(jié)構(gòu)特征是緊密相關(guān)的，如巖藻聚糖上的硫酸基團(tuán)的取代度[22]、分子量大小[23]及糖鏈的鏈接方式[24]，因此其結(jié)構(gòu)研究對其生物活性作用機(jī)理的闡明發(fā)揮著十分重要的作用。

2.2 糖鏈質(zhì)譜裂解碎片命名

多糖在質(zhì)譜中的糖鏈裂解模式如圖1，采用Costello等[25]命名的糖類碎片離子規(guī)則，以區(qū)分碎片離子的類型，斷裂后電荷保留在糖的還原端的離子被命名為Y、Z(糖苷鍵斷裂)和A(開環(huán)斷裂)，斷裂后電荷保留在非還原端的離子命名為B、C(配糖體斷裂)和X(開環(huán)斷裂)，其中開環(huán)斷裂離子A和X的上標(biāo)表示斷裂兩個(gè)鍵的位置。通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析識(shí)別和確認(rèn)這些類別的離子，就能得到糖鏈結(jié)構(gòu)的信息。同時(shí)多糖生物大分子及其寡糖的碎片在電噴霧電離質(zhì)譜中的負(fù)離子模式下易離子化且響應(yīng)度和靈敏度均較高。

圖2 糖鏈質(zhì)譜裂解碎片類型

2.3 巖藻聚糖中不含硫酸基團(tuán)寡糖鏈的質(zhì)譜裂解

巖藻聚糖經(jīng)部分酸水解后得到各種寡糖片段，將得到的含有大量結(jié)構(gòu)信息的寡糖通過質(zhì)譜的裂解碎片來分析寡糖的結(jié)構(gòu)，從而推導(dǎo)巖藻聚糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)。巖藻聚糖中常見的不含硫酸基團(tuán)的單糖及寡糖質(zhì)譜碎片如下，含有兩個(gè)單糖的寡糖[FucGlcA-H]-[26-27]，如圖3-A，其分子離子峰為m/z339.093，其中非還原端的巖藻糖經(jīng)過0,2A型糖環(huán)裂解產(chǎn)生較高強(qiáng)度的離子m/z 235.046，而碎片離子m/z 261.061為還原端的葡萄糖糖醛酸通過2,5A型裂解，此裂解方式為糖醛酸的特征裂解方式[16,26]，碎片離子m/z 193.033和碎片離子m/z 175.025分別為葡萄糖醛酸的分子離子峰及脫去一分子水后的碎片離子，即[FucGlcA-H]-的Y型裂解和Z型裂解。碎片離子m/z 355.089 為一分子六碳糖與一分子糖醛酸相連的寡糖的分子離子峰[27]，如如圖3-B，分子離子峰[GalGlcA-H]-，其裂解碎片m/z 295.063、m/z 277.054及m/z 265.055分別為還原端的葡萄糖醛酸的0,2A、2,5A及0,3A糖環(huán)裂解，其中0,3A的裂解方式可推測出該糖鏈的連接為(1→4)連接。碎片離子m/z 235.047 為[GalGlcA-H]-的非還原端半乳糖0,2X糖環(huán)裂解。

含四個(gè)單糖的寡糖[Fuc3GlcA-H]-分子離子峰為m/z 631.204[26]，如圖3-C，其主要碎片裂解方式為糖苷鍵的斷裂，產(chǎn)生Y型和Z型離子，該寡糖連接方式為Fuc-(1→3)-Fuc-(1→4)-Fuc-(1→3)-GlcA，從糖鏈左邊至右邊裂解，其中碎片離子m/z 485.147和碎片離子m/z 467.140為該寡糖非還原端的巖藻糖的Y3型和Z3型裂解離子，碎片離子m/z 339.097和碎片離子m/z 321.083為第二個(gè)巖藻糖的Y2型及Z2型裂解離子，碎片離子m/z 193.033和碎片離子m/z 175.025為葡萄糖醛酸與第三個(gè)巖藻糖連接處的Y1型及Z1型裂解離子。其它離子碎片主要為糖環(huán)裂解方式產(chǎn)生A型和X型的離子，如碎片離子m/z 571.189和碎片離子m/z 553.174分別為還原端的葡萄糖醛酸0,2A裂解碎片及2,5A裂解碎片，碎片離子m/z 527.159為非還原端的巖藻糖的0,2X糖環(huán)開環(huán)裂解碎片，碎片離子m/z 381.102為第二個(gè)巖藻糖的0,2X糖環(huán)開環(huán)裂解碎片，碎片離子m/z 235.045為第三個(gè)巖藻糖的0,2X糖環(huán)開環(huán)裂解碎片。

巖藻聚糖中含有[GlcAMan]n類型的兩個(gè)重復(fù)單糖的寡糖鏈[16]，如圖3-D，[GlcAMan]3，該寡糖結(jié)構(gòu)還原端為甘露糖，非還原端為葡萄糖醛酸，糖鏈連接方式主要為甘露糖的1，2連接和葡萄糖醛酸的1，4連接，其分子離子峰為m/z 1031，脫去一分子水后形成碎片離子為m/z 1013，其B型糖苷鍵裂解碎片主要有m/z 851、m/z 675、m/z 513、m/z 337、m/z 175；C型糖苷鍵裂解碎片主要有m/z 693、m/z 531、m/z 355；Y型糖苷鍵裂解碎片主要有m/z 693、m/z 355；Z型糖苷鍵裂解碎片主要有m/z 675、m/z 337、m/z 193。由于該寡糖碎片只含有兩種單糖，因此該寡糖在結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵裂解碎片B型裂解與Z型裂解有重合的碎片m/z 675、m/z 337，C型裂解與Y型裂解也有重合的碎片m/z 693、m/z 355。其還原端甘露糖0,2A型裂解碎片離子為m/z 911，與非還原端的葡萄糖醛酸相連的甘露糖的0,2A型裂解可產(chǎn)生碎片離子m/z 235，中間的甘露糖的0,2A型裂解可產(chǎn)生碎片離子m/z 573。

2.4 巖藻聚糖中含有硫酸基團(tuán)寡糖的質(zhì)譜裂解

巖藻聚糖中含有大量的硫酸基團(tuán)，其主要連接位置是在糖環(huán)上的2位和4位，巖藻聚糖中常見的含硫酸基團(tuán)的糖環(huán)有木糖、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖等，由于硫酸基團(tuán)在連接位置上的不同，糖環(huán)在質(zhì)譜中具有不同的裂解碎片，因而可以根據(jù)裂解碎片的不同來確定硫酸基團(tuán)在糖環(huán)上的取代位置。如含有一個(gè)硫酸基團(tuán)的木糖[26，28][XylSO3Na-Na]ˉ，如圖4-a和b，其2位取代和4位取代的分子離子峰均為m/z 229.003，2位取代的木糖經(jīng)過0,2X裂解產(chǎn)生裂解碎片m/z 138.970，而4位取代的木糖經(jīng)過0，2A裂解產(chǎn)生裂解碎片m/z 168.979。因此通過碎片離子m/z 138.970和m/z 168.979即可判斷該木糖的硫酸基團(tuán)的取代位置。同樣巖藻糖上硫酸基團(tuán)的2位取代和4位取代在質(zhì)譜中具有不同的裂解碎片，如2位取代的巖藻糖以m/z 139.0為基峰，而4位取代的巖藻糖以m/z 183.0為基峰，因而通過識(shí)別這兩個(gè)離子峰即可判別該巖藻糖硫酸基的取代位置。

另外寡糖[XylFucSO3][26]，如圖4-c，有三種可能的連接方式：第一種是木糖與含2位取代的硫酸基的巖藻糖以1，4糖苷鍵連接；第二種是巖藻糖與含2位取代的硫酸基的木糖以1，4糖苷鍵相連；第三種是含2位取代的硫酸基的巖藻糖與木糖以1，4糖苷鍵相連。以上三種形式的寡糖在質(zhì)譜中的分子離子峰均為m/z 375.059，其分子式為[XylFucSO3Na-Na]-。其中第一種連接方式在質(zhì)譜中的分子離子峰為m/z 375.059，巖藻糖糖環(huán)0,2X裂解產(chǎn)生離子碎片為m/z 138.972，木糖環(huán)0,2X裂解離子碎片為m/z 285.032，糖苷鍵Z型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 225.006，Y型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 228.996。第二種連接方式在質(zhì)譜中分子離子峰同樣是m/z 375.059，巖藻糖糖環(huán)0,2X裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 271.008，含硫酸基的木糖糖環(huán)0,2X裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 138.972，Y型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 228.996，Z型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 210.993。第三種連接方式在質(zhì)譜中分子離子峰為m/z 375.059，巖藻糖糖環(huán)0,2X裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 271.008，木糖糖環(huán)0,2A裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 315.043，糖苷鍵B型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 225.006，C型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 243.014。以上三種連接方式因含有硫酸基團(tuán)，在質(zhì)譜中具有不同的裂解碎片，所以可以通過以上的碎片來區(qū)分寡糖的連接方式。

圖3 不含硫酸基寡糖質(zhì)譜碎片裂解過程

圖4 含有硫酸基寡糖質(zhì)譜碎片裂解過程

寡糖[Fuc2HexSO3][27]，如圖4-d，同樣有三種可能的連接方式：第一種是非還原端為2位硫酸基取代的巖藻糖，還原端為六碳糖；第二種是非還原端為2位硫酸基取代的六碳糖，還原端為巖藻糖；第三種為非還原端為巖藻糖，還原端為2位硫酸基取代的六碳糖。三種連接方式的分子離子峰均為m/z 551.130，其中第一種連接方式的非還原端的巖藻糖進(jìn)行0,2X裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 447.070，非還原端巖藻糖與中間的巖藻糖之間的糖苷鍵B型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 225.010，中間巖藻糖與還原端的六碳糖之間的糖苷鍵B型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 371.001；第二種連接方式的非還原端的六碳糖與中間的巖藻糖之間的糖苷鍵B型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 241.000，中間的巖藻糖與還原端的巖藻糖之間的糖苷鍵B型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 387.060；第三種連接方式的非還原端的巖藻糖進(jìn)行0,2X裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 447.070，非還原端的巖藻糖與中間的巖藻糖之間的糖苷鍵進(jìn)行Y型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 405.070，中間巖藻糖與還原端的含硫酸基的六碳糖之間的糖苷鍵進(jìn)行Y型裂解產(chǎn)生離子碎片m/z 259.010。通過以上不同的離子碎片，可以判斷出該寡糖的連接方式及所含硫酸基團(tuán)的取代位置。

3 展望

多數(shù)巖藻聚糖是由多種單糖共同組成，其結(jié)構(gòu)具有非均勻性，支鏈較多，復(fù)雜程度高[29-30]，因而對糖鏈結(jié)構(gòu)的解析非常難，需結(jié)合各種化學(xué)物理方法獲得各種糖環(huán)信息，然后將所得到的信息進(jìn)行綜合，從而推測出糖鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其中電噴霧電離質(zhì)譜能針對巖藻聚糖非均勻性陰離子碳水化合物提供單糖的連接順序及基團(tuán)的取代位置，在含有硫酸基團(tuán)的巖藻聚糖中，電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)顯示出了強(qiáng)大的生命力，能提供非常豐富的結(jié)構(gòu)信息，成為多糖結(jié)構(gòu)解析的有力手段。雖然由于各種單糖的差異性小，均為差向異構(gòu)體，質(zhì)譜無法完全區(qū)分各種戊糖之間的差異及各種己糖之間的差異，同時(shí)無法準(zhǔn)確確定糖鏈中的全部連接方式，但是可以通過甲基化氣質(zhì)聯(lián)用共同獲得。隨著質(zhì)譜技術(shù)在多糖中的不斷應(yīng)用和發(fā)展，相信不久將來質(zhì)譜能區(qū)分各種差向異構(gòu)體的糖類，從而達(dá)到僅通過質(zhì)譜就能解析出多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多糖領(lǐng)域的發(fā)展。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Application of ESI Mass Spectrometry In Structural Analysis of Fucoidan

Hu Pei1，2, Wu Bin2, Li Zhixiong2﹡

(1.The Affiliated Shuguang Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203,China; 2.Shanghai Institute of Materia Medica of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203,China)

The article review ionization theory of ESI MS, ionization mechanism of ESI in polysaccharide, and the application of ESI mass spectrometry in structural analysis of fucoidan.

Electrospray Ionization Mass Spectrometry; Fucoidan; Structrural Analysis; Review

2014-01-09

國家科技重大專項(xiàng)《重大新藥創(chuàng)制》課題資助項(xiàng)目(2012ZX09301001-003)

胡培(1988-),男，上海中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。

李志雄(1975-)，男，中國科學(xué)院上海藥物研究所高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。

R962

A

1673-2197(2014)09-0046-04