周朋等

摘 要 為準(zhǔn)確定量香蕉束頂病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）DNA1組分在香蕉組織中的分布和含量，建立以SYBR Green-I熒光染料為標(biāo)記的實時熒光定量PCR（Real Time Fluorescence Quantitative PCR）方法。利用B1-F/B1-R引物擴增海南BBTV DNA1組分并構(gòu)建到pMD18T sample載體，再以B2-F/B2-R引物測定該質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為Y=-3.247×LOG（X）+8.01，相關(guān)系數(shù)r2=0.997，擴增效率為103.2%，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測靈敏度約為214 copies/μL。分別選取染病香蕉的嫩葉、葉鞘、假莖和球莖各100 mg，提取DNA并進行實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明：病株各部位均含BBTV病毒，但含量有明顯差異，其中嫩葉（3.08×108 copies/mg）>葉鞘（2.50×108 copies/mg）>假莖（1.29×108 copies/mg）>球莖（1.67×107 copies/mg），呈依次遞減。

關(guān)鍵詞 香蕉束頂病毒；實時熒光定量PCR；病毒含量

中圖分類號 S668.1 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract To accurately measure the distribution or amount of Banana bunchy top virus DNA1 component in banana leaf， sheath， pseudostem and corm tissues， the real-time fluorescence quantitative PCR method was used to study in this paper. A 978 bp nucleotide sequence of DNA1 was obtained by B1-F/B1-R primers and ligated to pMD18T sample vector as a plasmid standard. The plasmid standard curve was determined by the real-time fluorescence quantitative PCR by B2-F/B2-R primers with the linear equation Y=-3.247×LOG（X）+8.01， correlation coefficient r2=0.997， and amplification efficiency 103.2%. The minimum detectable amount of the standard plasmid is approximately 214 copies/μL. The infected banana leaves， sheaths， pseudostems and corms of 4 samples were taken for DNA extraction， and real-time quantitative PCR results showed that BBTV virus was existed in these tissues. However， there are significant differences in the amount in leaf（3.08×108 copies/mg）， sheath（2.50×108 copies/mg）， false stem（1.29×108 copies/mg）and corm（1.67×107copies/mg）， presenting in descending order.

Key words BBTV； Real-time fluorescence quantitative PCR； Virus measurement

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.07.023

香蕉束頂病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）屬矮化病毒科（Nanoviridae）香蕉束頂病毒屬（Babuvirus），是香蕉束頂?。˙anana bunchy top disease，BBTD）的病原[1-3]。染病香蕉葉片背部有深綠色條紋，并向葉片中脈延伸，葉片聚束造成植株發(fā)育不良，嚴重影響果實的生長[3]。BBTV為18～20 nm的等徑二十面體粒體，基因組至少由6個環(huán)狀單鏈DNA組分組成，編碼不同的蛋白，DNA1編碼復(fù)制起始蛋白（Replication initiation proteins，Rep）[4-5]，DNA2編碼未知蛋白[6]，DNA3編碼外殼蛋白質(zhì)（Coat protein，CP）[7]，DNA4編碼運動蛋白（Movement protein，MP）[8]，DNA5編碼Rb-結(jié)合蛋白（Rb-binding-like protein）[8]，DNA6編碼核穿梭蛋白（Nuclear shuttle protein，NSP）[1， 8]。而DNA 1序列的高度保守性是BBTV分組的標(biāo)準(zhǔn)之一[9]。

近年來，實時熒光定量PCR在病毒方面的研究已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一個熱點，特別在病毒、細菌和病原體的定量檢測、監(jiān)測具有獨特的優(yōu)勢[10]。與傳統(tǒng)PCR相比，熒光定量PCR能實時監(jiān)控PCR反應(yīng)的進程并準(zhǔn)確定量，靈敏度大約是傳統(tǒng)PCR的10～100倍[11]。利用實時熒光定量PCR檢測BBTV已多有報道，如Chen等[12]通過Taqman探針法對病株進行了檢測，F(xiàn)u[13]和Watanabe[14]通過SYBR法對病株和媒介分別進行了檢測。但利用實時熒光定量PCR檢測BBTV在香蕉寄主各組織器官的含量分布未見報道。本研究首先建立了以DNA1為模板、SYBR Green-I熒光染料為標(biāo)記的實時熒光定量PCR方法，然后對染病香蕉的嫩葉、葉鞘、假莖和球莖BBTV含量進行檢測。本研究的染病香蕉BBTV DNA1在各部位定量檢測對海南香蕉的生產(chǎn)和病毒病的控制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 具有典型BBTD癥狀、經(jīng)間接酶聯(lián)免疫法（ID-ELISA）檢測為陽性的巴西蕉（Musa spp.）植株，取自?？诘貐^(qū)，由本實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和載體 E.coli Competent cells DH5α和pMD18-T Simple Vector均購自TaKaRa公司。

1.1.3 試劑及儀器 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒和植物DNA提取試劑盒均購自TIANGEN公司（中國北京）；Easy Taq DNA Polymerase購自北京全式金技術(shù)有限公司；SYBR Premix Ex Taq、PrimeScript Reverse Transcriptase、DNA Marker DL 2000均購自TaKaRa公司；實驗所用實時熒光定量PCR儀為Stratagene Mx3005P。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)本實驗室報道的BBTV海南分離物DNA1組分（AY494788、HQ378190、HQ616074和FJ463042）保守序列設(shè)計2對特異引物B1-F/B1-R和B2-F/B2-R，擴增片段長度分別為978、236 bp。引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

1.2.2 香蕉總DNA的提取 從冰箱中取0.5 g感染BBTV的香蕉嫩葉組織，液氮研磨，取100 mg按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取病樣總DNA，溶于50 μL體積水中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 pMD18T-DNA1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 以病株的總DNA為模板，以B1-F/B1-R為引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：10×Easy Taq buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Easy Taq DNA Polymerase 0.2 μL，DNA模板1 μL （20 μg），加ddH2O 11.0 μL至總體積為25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。將擴增得到的DNA1片段切膠回收，連接至pMD18-T Simple載體上，最后選取3個克隆子送往生工測序部測序。對測序正確的陽性克隆菌提取質(zhì)粒，溶于50 μL ddH2O中，稀釋100倍后用Thermo Nanodrop 2000測定pMD18T-DNA1濃度并進行拷貝數(shù)換算[拷貝數(shù)=（50×A×n）/B×6.02×1014，其中A代表吸光度值，n代表稀釋倍數(shù)，B代表質(zhì)粒分子量]。

1.2.4 實時熒光定量PCR預(yù)實驗 分別以pMD18T-DNA1和病株總DNA為模板，以B2-F/B2-R為引物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系參照1.2.3。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；然后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；降至16 ℃反應(yīng)結(jié)束。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10的梯度倍數(shù)稀釋9個梯度（共10個梯度），并以此作為模板，進行實時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：SYBR Premix EXTaqTM（2×）12.5 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.5 μL，引物B2-F/B2-R各0.5 μL，梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板1 μL，加ddH2O 10.0 μL至總體積為25 μL。反應(yīng)程序參照1.2.4。反應(yīng)結(jié)束后，實時熒光定量PCR儀（Stratagene Mx3005P）根據(jù)結(jié)果自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 實時熒光定量PCR與普通PCR的靈敏度比較 另一組也以同樣梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，反應(yīng)體系同1.2.5，反應(yīng)程序按照1.2.4，進行普通PCR檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 BBTV含量的測定 以本實驗室保存的4棵香蕉病株為材料，分別取其嫩葉、葉鞘、假莖和球莖各100 mg，共16個樣品，按照植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，溶于50 μL H2O中，反應(yīng)體系同1.2.5，反應(yīng)程序按照1.2.4，進行實時熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA的提取

取5 μL總DNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：條帶清晰，無明顯彌散帶，可作為模板用于后續(xù)的PCR擴增。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

測序結(jié)果表明，3個陽性克隆子序列一致，均來自BBTV DNA1序列。經(jīng)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST分析結(jié)果表明，本實驗擴增獲得的DNA1序列與GenBank公布的BBTV Haikou-4 DNA1序列（HQ378194）同源性最高，達到99.28%。提取質(zhì)粒，稀釋100倍后經(jīng)Thermo Nanodrop 2000測得OD280為0.017，計算得出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為2.14×109 copies/μL。

2.3 引物驗證

采用引物B2-F/B2-R擴增標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18T-DNA1和病株總DNA，結(jié)果均得到一條大小約236 bp的單一條帶，無非特異性擴增、無二聚體，健康香蕉總DNA和水空白均無擴增條帶（圖1）。

2.4 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

實時熒光定量PCR儀（Stratagene Mx3005P）生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為Y=-3.247×LOG（X）+8.01，標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴增效率（E）為103.2%，拷貝數(shù)對數(shù)與Ct值之間的相關(guān)系數(shù)（r2）為0.997，該標(biāo)準(zhǔn)曲線完全可滿足實驗的可信度要求，如圖2所示。目的片段TM值為86 ℃（圖3），溶解曲線為單一峰，特異性強。

2.5 實時熒光定量PCR靈敏度檢測

應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測BBTV DNA1，PCR反應(yīng)為35個循環(huán)時，可檢測到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒靈敏度為10-7，即樣品濃度為2.14×102 copies/μL（圖4）。而普通PCR檢測的靈敏度是10-5，即2.14×104 copies/μL（圖5）。此結(jié)果表明實時熒光定量PCR檢測BBTV DNA1的靈敏度是普通PCR的100倍左右。

2.6 BBTV含量的測定

實時熒光定量PCR結(jié)果表明，4棵病株各部位均含BBTV，但含量有明顯差異。對4個樣品的Ct值換成拷貝數(shù)后，取平均值，其中，嫩葉（3.08×108 copies/mg）>葉鞘（2.50×108 copies/mg）>假莖（1.29×108 copies/mg）>球莖（1.67×107 copies/mg），呈依次遞減（圖6）。球莖的標(biāo)準(zhǔn)差較小，表明BBTV在該部位含量波動較??；而嫩葉、葉鞘和假莖的標(biāo)準(zhǔn)差大，說明BBTV在嫩葉、葉鞘和假莖的個體差異大。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，病株各組織均含有BBTV病毒，但含量有明顯差異，其中嫩葉最高，葉鞘次之，假莖第三，球莖最低。趨勢與賴星華等[15]的探針法和范國成等[16]的抗體結(jié)合法檢測結(jié)果基本吻合。BBTV侵染香蕉形成侵染點后會向植株的其他部分轉(zhuǎn)移，形成系統(tǒng)感染，最終使香蕉植株矮縮、束頂，無果或果實變小。病毒在香蕉各組織中的含量與很多因素有關(guān)，如寄主的基因、病毒的基因、寄主的防御機制、從侵染點到植株其部分的維管束和環(huán)境條件等。這些或者其它的因素最終使病毒在植株各組織的分布不均。

BBTV為多組分ssDNA病毒，各組分表達的不同蛋白行使著不同的生物學(xué)功能。其中DNA1表達的復(fù)制酶基因是病毒復(fù)制的必需組分，其表達量的高低可能決定病毒顆粒的多少。相對于其它植物病原微生物，植物病毒的核酸序列具有簡單、重復(fù)和長度短等特點。BBTV除DNA2組分外，其它5個組分均比較保守，其中又以DNA1保守性最好。以此為依據(jù)，本研究在BBTV DNA1組分的高度保守區(qū)域設(shè)計特異引物，針對性強、特異性高。熒光染料實時定量PCR方法所用的引物必須高度特異，無二聚體。引物驗證結(jié)果表明，本實驗前期所設(shè)計的5對引物中篩選出了最優(yōu)的1對引物，即B2-F/B2-R。

用于本研究的4棵香蕉病株在不同香蕉大田中選取，其水肥環(huán)境和感染病毒的早晚可能不一致，所以各株間同一組織的病毒含量也有差異。其中葉鞘的差異最大，球莖差異最小，但各株總體分布趨勢趨于一致，使結(jié)果更具有代表性。本研究建立的方法與DNA探針法和抗體方法相比，其優(yōu)點在于能定量檢測BBTV在染病香蕉各組織的含量，且靈敏度高、特異性強，也可用于檢測組培苗和交脈蚜等病毒含量較低的材料。

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