黃世臣　趙敏

摘要[目的]分離與鑒定1株產(chǎn)膽紅素氧化酶的新菌株。[方法]利用常規(guī)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，從玉米葉片的病斑中分離出一株產(chǎn)膽紅素氧化酶（bilirubin oxidase，BOD）的絲狀真菌。[結(jié)果]通過形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和rDNAITS（登錄號(hào)為JN251106）序列分析，該菌株被鑒定為Bipolaris australiensis，命名為B.australiensis HD1，屬子囊菌門格孢腔菌目格孢腔菌科平臍蠕孢屬澳大利亞平臍蠕孢霉（B.australiensis），亦稱澳洲雙孢霉，是1株沒有被報(bào)道過的具有產(chǎn)BOD的新產(chǎn)生菌；在不含任何誘導(dǎo)劑的發(fā)酵液中28 ℃，150 r/min，培養(yǎng)6 d，其酶活可達(dá)為1 000 U/L。[結(jié)論]該方法成功分離出1株產(chǎn)膽紅素氧化酶的新菌株，為BOD的產(chǎn)生菌提供了新的微生物來源。

關(guān)鍵詞膽紅素氧化酶；Bipolaris australiensis；分離鑒定

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）12-03486-05

基金項(xiàng)目中國國家林業(yè)廳984項(xiàng)目（2012-4-03）；自然科學(xué)基金（31170553，30671702，30170775）。

作者簡介黃世臣（1973- ），男，吉林東遼人，副教授，從事環(huán)境微生物學(xué)的教學(xué)與研究。*通訊作者，從事環(huán)境微生物學(xué)的教學(xué)與研究。

膽紅素氧化酶（EC 1.3.3.5）因其能催化膽紅素氧化而得名，是由日本學(xué)者最早從絲狀真菌（Myrothecium verrucaria）中分離并純化出來[1]。現(xiàn)代研究表明，該酶屬多銅氧化酶家族中一個(gè)成員。到目前為止，被文獻(xiàn)報(bào)道的該酶微生物來源不足10種[2]，而被商業(yè)化生產(chǎn)的只有2種，分別為Myrothecium verrucarria和Trachyderma tsunodae。因該酶在醫(yī)療衛(wèi)生[3-6]和生物燃料電池[7-11]領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。從近5年來的文獻(xiàn)數(shù)量上變化情況看，該酶現(xiàn)已逐漸成為多銅氧化酶家族中研究的熱點(diǎn)。膽紅素氧化酶與漆酶同屬多銅氧化酶家簇成員，而漆酶遠(yuǎn)比膽紅素氧化酶的物種報(bào)道的多（漆酶目前已被鑒定的有220種），但膽紅素氧化酶具有漆酶無法比擬的特性，如在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定、對(duì)Cl-的高耐受性、高熱穩(wěn)定性、可專一氧化膽紅素等可在生物燃料電池及醫(yī)學(xué)臨床診斷上被廣為利用?；诖?，筆者從環(huán)境中對(duì)產(chǎn)生該酶的微生物進(jìn)行大量的篩選和鑒定研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。土壤樣品，采自黑龍江省伊春市涼水國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的針葉闊葉混交林，吉林省長白山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的針葉闊葉混交林，吉林省龍井市水稻田土壤；植物病害葉片樣本由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)教研室白慶榮博士饋贈(zèng)。

1.1.2主要儀器。UV2800紫外可見分光亮度計(jì)，購自尤尼柯（上海）儀器有限公司；Nikon ECLIPSE TE 2000E尼康倒置顯微鏡，購自日本尼康公司；Eppendorf centrifuge 5418離心機(jī)，購自Germany；純水儀，購自MilliPore公司。

1.1.3主要試劑。膽紅素結(jié)晶，購自Adamasbeta（Switzerland），吸光系數(shù)1 038 g/L（產(chǎn)家提供）；DNA凝膠回收試劑盒，購自北京莊盟公司；pMD18T載體，購自大連寶生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或更高級(jí)純品。

1.2方法

1.2.1溶液的配制。①培養(yǎng)基的制備。培養(yǎng)基配方見文獻(xiàn)[12]，真菌分離培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬丁氏培養(yǎng)基；細(xì)菌分離培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌富集培養(yǎng)基為PDA；細(xì)菌富集培養(yǎng)基酵母提取物蛋白胨氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。真菌總DNA提取培養(yǎng)基為改良Mandels培養(yǎng)基[13]。②酶活測定緩沖液的配制。15 mmol/L TrisHCl pH 8.1，含1.0 mmol/L EDTANa2·2H2O，稱取Tris base 1.815 g 溶于1 000 ml蒸餾水中，在37 ℃水浴中用濃鹽酸調(diào)pH至7.4～7.6，加入0.336 g EATANa2·2H2O，充分溶解后備用。③膽紅素溶液的配制。稱取膽紅素結(jié)晶2.0 mg，放入1.5 ml EP管中，加入0.5 ml無水甲醇，用槍吸打混勻，再逐滴加入預(yù)冷的0.2 mol/L無水碳酸鈉溶液0.5 ml，用槍吸打混勻，置-20 ℃下備用5 d內(nèi)使用。

1.2.2引物。①rDNAITS序列通用引物。ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′；ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′。②菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子引物。M13：5′CGCCAGG GTTTTCCCAGTCAACGAC3′；RVM：5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′。以上所有引物均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.3菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及酶活檢測。將來源于不同分離培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，依據(jù)外在性狀的差異及時(shí)用接種鉤或接種環(huán)以稀釋涂布、單孢分離、平板劃線等方法將其轉(zhuǎn)移至另一裝有相同培養(yǎng)基質(zhì)的無菌平板中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接，獲得其純培養(yǎng)并編號(hào)，然后，通過富集培養(yǎng)獲得大量的接種物，將分離富集的菌株分別恒溫振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌懸液用離心的方法去除菌體，吸取上清作為粗酶液用于檢測其是否產(chǎn)膽紅素氧化酶。

每個(gè)三角瓶（250 ml）中加入培養(yǎng)基100 ml，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，接入適量的新鮮富集培養(yǎng)物，真菌以每個(gè)三角瓶中加入一塊固態(tài)平板培養(yǎng)的接種物（菌落直徑1 cm）；細(xì)菌以平板培養(yǎng)24 h的菌體用滅菌水5 ml稀釋混均后吸取100 μl接種于三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)。真菌放于28 ℃的恒溫振蕩搖床120 r/min搖動(dòng)6 d后檢測酶活；細(xì)菌置于37 ℃的恒溫振蕩搖床120 r/min搖動(dòng)2 d后檢測酶活。

1.2.4膽紅素吸收波長測定。取適量的膽紅素晶體用1∶1（V/V）的甲醇和NaCO3（0.2 mol/L）溶液溶解后取20 μl與2.95 ml酶活測定緩沖液混均，吸入石英比色皿內(nèi)，用酶活測定緩沖液調(diào)零后，在UV2102C/PC/PCS型分光亮度計(jì)上進(jìn)行全波長掃描，掃描波長靈敏度設(shè)為1 nm。

1.2.5膽紅素氧化酶的酶活定性及定量檢測。①酶活定性檢測。用移槍吸取2.5 ml緩沖液于小玻璃試管中，并將其置于37 ℃水浴中10 min預(yù)熱；吸取經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)液離心后所得上清0.5 ml放入小試管中，預(yù)熱5 min后，加入膽紅素溶液20 μl（2 mg/ml），觀察溶液的顏色是否變綠，變綠者為產(chǎn)生膽紅素氧化酶的菌株。②酶活定量檢測。在37 ℃條件下，氧化1 μmol膽紅素所需要的酶量定義為一個(gè)酶活。

1.2.6形態(tài)學(xué)鑒定。①菌落形態(tài)顯微鑒定。將產(chǎn)生膽紅素氧化酶的菌株接種于PDA平板上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)。②菌絲形態(tài)顯微鑒定。挑取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后的新生菌絲體少許，置于含有浮酚油的載玻片上，用解剖針小心將菌絲分開，在倒置顯微鏡下觀察菌絲的顏色、隔膜有無等。③分生孢子和分生孢子梗顯微形態(tài)鑒定。將菌株接種于水洋菜-麥桿培養(yǎng)基中，于20 ℃、360 nm近紫外燈照射，12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)。每24 h鏡檢觀察一次菌落大小、顏色，分生孢子的大小、數(shù)量、隔膜產(chǎn)生等。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年1.2.7生理學(xué)鑒定。①分生孢子隔膜形成次序。將目標(biāo)菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d后，剝?nèi)ゾ涞谋砻鏆馍z，用挑針挑取帶有培養(yǎng)基直徑為1 cm的菌塊放于培養(yǎng)皿中的濾紙上（含有內(nèi)含3～5層濾紙，事先用滅菌水將其濕透），置于20 ℃下放置6 d后鏡檢，以后每隔1～2 h觀察1次。②分生孢子萌發(fā)方式。取一潔凈的載玻片，將濾紙片剪成與其大小相近的紙片，同時(shí)在濾紙片的中央處剪一邊長約為0.5 cm的正方形小孔，用水濕潤濾紙后將其附著于載玻片上，然后將此載玻片放入培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿內(nèi)事先放置3層濾紙并用滅菌水浸潤，用報(bào)紙將培養(yǎng)皿包好后高壓滅菌。待培養(yǎng)皿溫度降至室溫后，取培養(yǎng)5 d的PDA平板用接種鉤挑取一定量的菌體（含有菌絲和分生孢子）均勻得涂布在正方形濾紙周圍，置于28 ℃上恒溫培養(yǎng)，每隔24 h鏡檢一次。③分生孢子在分生孢子梗上的產(chǎn)孢方式。處理方法同“②”，保濕培養(yǎng)2～4 d后鏡檢。④最適生長溫度。菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d，在無菌條件下，用滅菌的打孔器（直徑0.5 cm）將菌落切割為大小一致接種體，將其接種于PDA平板中央，每一平板接種一塊接種體，28 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)24 h后，將平板分別置于5、25、28、30、35和40 ℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)3 d測量菌菌直徑；每處理3次平行。⑤最適生長pH值。配PDA培養(yǎng)基，在加入瓊脂前等待培養(yǎng)基溫度降至室溫后調(diào)pH值，pH設(shè)置為4、5、6、7、8、9和10，分別加入瓊脂后高壓滅菌。接種后，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)108 h后測量菌落直徑；每處理3次平行。

1.2.8分子鑒定——rDNAITS序列分析。①真菌基因組DNA提取。用改進(jìn)的CTAB法提取真菌染色體DNA[12]。②ITS序列擴(kuò)增。真菌ITS序列通用引物[13]為ITS1和ITS4；PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表1和表2，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。③目的片段的純化。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切取含有目的片段的膠塊轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。④目的片段的克隆與轉(zhuǎn)化。取純化的PCR產(chǎn)物2 μl，按說明書上的方法與pMD18T載體連接3 h后，將連接物轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)E.coli JM109細(xì)菌細(xì)胞中，并將其置于LB液體培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，取100 μl轉(zhuǎn)化菌液，均勻地涂在含Xgal、IPTG和Amp的LB平板上，并設(shè)不含Amp的LB平板作對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。⑤重組子篩選與鑒定。隨機(jī)挑取7個(gè)白斑菌落分別接種于1.0 ml LB培養(yǎng)基中，200 r/min，培養(yǎng)4 h，取2 μl作為菌落PCR的模板；PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序見表3和表4；取4 μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。⑥r(nóng)DNAITS序列測定與分析。將確定為陽性克隆的菌液送上海生物工程公司進(jìn)行測序。在測序結(jié)果中找到目的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對(duì)，下載相關(guān)序列，采用Mega5.1軟件對(duì)序列進(jìn)行親緣性及系統(tǒng)發(fā)育分析。

2結(jié)果與分析

2.1膽紅素的最大吸收波長測定圖1表明，膽紅素在440 nm處有最大吸收峰，因此試驗(yàn)中膽紅素氧化酶的酶活測定波長選定在440 nm處。

2.2形態(tài)學(xué)鑒定通過對(duì)不同來源的土壤樣品和植物葉片

鄰接法建樹程序建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖10）。對(duì)比結(jié)果顯示，HD1菌株與Bipolaris sp.，Cochliobolus geniculatus，Pleosporaceaesp.，Dothideomycete sp.，Bipolaris papendorfii和Pleosporaceae sp.6株菌物有100%的同源性，但序列間的自展支持率卻不高（低于65%）。鄰接樹中的Cochliobolus geniculatus為cynodontis的同種異名。Cochliobolus屬為Bipolaris屬的有性型，在試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)其有性型。系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明，研究所提交的序列在NCBI庫中的比對(duì)結(jié)果只能提供種屬鑒定的部分分類鑒定信息，最終的種屬鑒定有必要結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面的數(shù)據(jù)支持。

結(jié)合形態(tài)學(xué)，生理學(xué)和rDNAITS序列分析結(jié)果及文獻(xiàn)信息[14]，菌株HD1被鑒定為Bipolaris australiensis。注：標(biāo)“*”為研究提交序列；括號(hào)內(nèi)字母及數(shù)字為基因登錄號(hào)；標(biāo)尺代表序列間差異為0.5%；節(jié)點(diǎn)處數(shù)字為自展值。

圖10鄰接法建菌株HD1系統(tǒng)發(fā)育樹3結(jié)論

試驗(yàn)從患病玉米葉片中分離出1株產(chǎn)膽紅素氧化酶的真菌菌株，通過形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和rDNAITS序列分析，該菌株被鑒定為Bipolaris australiensis，命名為B.australiensis HD1，屬子囊菌門格孢腔菌目格孢腔菌科（Pleosporaceae）平臍蠕孢屬（Bipolaris）澳大利亞平臍蠕孢霉（Bipolaris australiensis），亦稱澳洲雙孢霉，是一株沒有被報(bào)道過的具有膽紅素氧化酶酶活性的新菌株，該菌物在無誘導(dǎo)劑存在下，28 ℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)6 d后，酶活可達(dá)1 000 U/L，為膽紅素氧化酶的產(chǎn)生菌提供了新的微生物來源。

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