張秀英 宋瑞清 理永霞等

摘要[目的] 研究潰瘍病菌誘導(dǎo)下毛白楊防御相關(guān)基因的應(yīng)答反應(yīng)。[方法] 以毛白楊為試驗材料，用潰瘍病菌對7月齡幼苗進行接種，提取誘導(dǎo)前后的毛白楊樹皮mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，構(gòu)建72 h差異表達的SSHcDNA文庫。隨機挑選199個陽性克隆進行測序，將測序結(jié)果與NCBI基因庫中序列進行比較，并對這些EST在dbEST數(shù)據(jù)庫進行同源檢索分析，利用RTqPCR對文庫中7個基因進行進一步分析。[結(jié)果] 172個EST找到了同源序列，其中有32個序列與防御相關(guān)。在毛白楊受到潰瘍病菌誘導(dǎo)時，這些防御基因的表達量明顯上升。[結(jié)論]該研究為開展毛白楊抗?jié)儾≈匾δ芑虻目寺『丸b定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞毛白楊；葡萄座腔菌；防御相關(guān)基因；抑制性消減cDNA文庫；實時熒光定量PCR

中圖分類號S763.13文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）12-03555-04

基金項目林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201204501）；中國林科院院部基金（CAFYBB2011005-4）；科技部基礎(chǔ)性工作專項（2009FY210100）。

作者簡介張秀英（1977-），女，山東平原人，講師，在讀博士，從事分子生物學(xué)研究。*通訊作者，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，從事森林病理學(xué)研究。

楊樹潰瘍病是一種慢性病，主要危害樹干，分布廣泛，嚴(yán)重影響了楊樹幼苗及幼樹的生長，已成為影響我國楊樹人工林發(fā)展的主要因素之一。目前，對楊樹-病原相互作用的分子機制研究主要集中在楊樹與銹菌[1-2]和楊樹與楊盤二孢菌[3]的相互作用研究，而對楊樹-潰瘍病菌的相互作用的分子機制研究較少[4]，從基因組水平上研究病原菌的致病機理和機制更少。由于互作系統(tǒng)本身的復(fù)雜性，要探究植物與病原菌互作的響應(yīng)機制，闡明其中的分子機理，需要進一步深入開展關(guān)于基因調(diào)控機理方面的研究。

Diatchenko等[5]建立以PCR為基礎(chǔ)的差減雜交技術(shù)，具有高靈敏性、目的序列富集程度高、操作簡便、豐度相對一致等優(yōu)點。該技術(shù)因其顯著特點受到廣泛關(guān)注，已成為差異表達基因的有效分離方法，迄今為止在林木病害研究中已有許多報道[6-7]。筆者用潰瘍病高抗品種毛白楊作為試驗材料，接種潰瘍病菌（Botryosphaeria dothidea）72 h后構(gòu)建cDNA文庫，同時利用獲得的EST測序結(jié)果進行實時PCR驗證，進一步研究楊樹樹皮在潰瘍病菌誘導(dǎo)后的基因表達情況。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1植物材料。毛白楊（Populus tomentosa Carr.），高抗樹種，15年生，感病指數(shù)為0～6.0[8]，生長于中國林業(yè)科學(xué)院內(nèi)，采摘1年生健康枝條，扦插1個月苗木生根后，挑選生長狀態(tài)一致的幼苗進行定植，幼苗長至7月齡時用于試驗。

1.1.2 病原菌及接種方法。試驗菌株為Botryosphaeria dothidea菌株，菌株號為CXY001，分離于楊樹潰瘍病斑，經(jīng)單孢培養(yǎng)鑒定，再回接，以此確認(rèn)致病性（致病力中等），保存于中國林科院菌種保藏中心。試驗前，先將病原菌活化，參考趙仕光等的接種方法并稍加修改[9]。接種72 h后取樣，截取病健交界處0.5 cm×1.0 cm長條形樹苗干部樹皮（帶形成層），約每500 mg樣品用錫鉑紙包成1包后，迅速投入液氮中，于-80 ℃下貯存?zhèn)溆茫▓D1）。對照采用接種無菌培養(yǎng)基后72 h取樣。

1.2試驗方法

1.2.1 總RNA提取及mRNA的純化。采用鼎國公司的植物RNA提取試劑盒提取毛白楊樹皮的總RNA，使用Plant RNAzol試劑盒提取真菌的總RNA，使用微量紫外分光光度計進行RNA定量測定，利用Promega公司的mRNA分離純化試劑盒[PolyA Tract SystemsⅢ（Z5300）]分離純化mRNA，通過電泳檢測其完整性。

1.2.2 構(gòu)建抑制差減文庫及重組子的鑒定。利用Clontech公司的抑制性消減雜交文庫構(gòu)建試劑盒（PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit）構(gòu)建潰瘍病菌誘導(dǎo)毛白楊72 h的差減文庫。在試驗過程中以真菌接種處理的楊樹樹皮作為試驗方（Tester）；參照方（Driver）一部分來源于培養(yǎng)基處理的楊樹樹皮的mRNA，一部分來源于培養(yǎng)基培養(yǎng)的真菌mRNA（圖2）。將消減雜交反應(yīng)后得到的cDNA與 pMD19T載體連接，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，振蕩培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)化菌涂在含有Amp抗性的LB平板上，37 ℃下培養(yǎng)16 h，通過藍白斑篩選挑出陽性克隆，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（含有Amp/LB液體培養(yǎng)基），搖床培養(yǎng)。吸取菌液，PCR擴增，檢測插入片段的大小。

注：a.B. dothidea菌誘導(dǎo)毛白楊 72 h，作為試驗方；b.培養(yǎng)72 h的菌絲；c.PDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)毛白楊72 h。將培養(yǎng)72 h的菌絲與PDA培養(yǎng)基誘導(dǎo)72 h的毛白楊按1∶1（mRNA）的比例混合，作為參照方。

1.2.3 抑制消減雜交文庫測序及序列分析。抑制消減雜交文庫測序由鼎國公司完成，將獲得的EST序列進行EST前處理，剔除不符合要求的序列，然后遞交NCBI網(wǎng)站，通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST（或者BLASTN）序列比對工具，在GenBank 的dbEST數(shù)據(jù)庫上對EST序列進行同源檢索分析。

1.2.4 Realtime PCR定量檢測。使用7月齡苗木進行接種試驗。以不接種潰瘍病菌毛白楊苗木作為對照方，以接種潰瘍病菌的毛白楊作為測試方，分別于接種后12、24、48、72、96和144 h取樣，剪取對照和接種材料的樹皮置于液氮中，-80 ℃下保存?zhèn)溆?。每個接種時間處理5株毛白楊，重復(fù)3次。

以EF1α作為內(nèi)參基因，根據(jù)內(nèi)參基因設(shè)計特異性引物，依此來設(shè)計PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)及目的基因擴增的模板量。使用SYBR GREEN PCR MasterMix（TOYOBO）試劑盒進行熒光實時定量RTPCR，在7500循環(huán)儀（Biorad）進行實時定量PCR反應(yīng)。Realtime PCR 反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Supermix（Qiagen）15 μl、正向和反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，45個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對實時定量PCR結(jié)果進行定量分析，引物見表1。

2結(jié)果與分析

2.1 酶切效果分別取2 μg試驗方和參照方的mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成雙鏈cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶RsaⅠ酶切，結(jié)果表明RsaⅠ酶切后酶切的cDNA 大小范圍明顯小于未酶切的cDNA，說明酶切完全，符合試驗要求，可以用于差減文庫的構(gòu)建（圖3）。

2.2文庫篩選及插入片段大小 RsaⅠ酶切后進行接頭連接和2輪雜交，接著進行2輪抑制PCR，參照方和試驗方的大部分共有序列已被差減消除，不同表達序列得到進一步富集。隨機挑取100個克隆進行質(zhì)粒抽提，再進行PCR擴增和凝膠電泳，其中有95個存在有效產(chǎn)物?？寺〉牟迦肫未笮》秶鸀?00～500 bp，與SSH預(yù)期插入片段的大小吻合。

2.3抑制差減文庫差減效率分析經(jīng)2次差減后的內(nèi)參Tub基因，在經(jīng)過28個循環(huán)后，隱約可見擴增條帶，比未差減對照（經(jīng)23個循環(huán)出現(xiàn)清晰的目的條帶）出現(xiàn)擴增條帶的時間晚，說明了經(jīng)過2次抑制PCR后只保留了試驗方受潰瘍病菌侵染后，誘導(dǎo)表達的基因，試驗方和參照方中共同轉(zhuǎn)錄的基因得到了有效扣除（圖4）。

2.5目標(biāo)基因表達模式的Realtime PCR分析從構(gòu)建的文庫中選取7個基因（蛋白），利用實時定量PCR分析其在6個時間點（12、24、48、72、96 和144 h）的表達情況。從圖5可以看出，CXY1446、CXY0504、CXY1313和CXY142這4個基因在潰瘍病菌菌誘導(dǎo)后表達趨勢基本一致，即誘導(dǎo)12 h后表達水平升高；隨著誘導(dǎo)時間的增長，這4個基因的表達水平也隨之升高；CXY0112、CXY1804和CXY1727這3個基因的變化趨勢基本相同，即在潰瘍病菌菌誘導(dǎo)12 h 后這3個基因的表達水平都下降；誘導(dǎo)24 h 后隨著誘導(dǎo)時間的增加，基因表達量逐漸升高，其中CXY0112基因的表達水平增加了90倍。

3 討論

抑制差減雜交技術(shù)是從基因組水平研究差異表達基因的重要方法之一，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種植物中[10-13]。筆者通過抑制差減雜交技術(shù)分析了潰瘍病菌誘導(dǎo)毛白楊后基因的表達情況，從中獲得了一些可能參與防御的候選基因。

在生物體的多種代謝反應(yīng)中，苯丙烷代謝與抗病反應(yīng)有著緊密關(guān)系，而細(xì)胞色素P450恰恰是這個途徑的關(guān)鍵酶。該研究P450（CXY1804）表達水平先升后降，誘導(dǎo)24 h后表達水平持續(xù)穩(wěn)定增長，表明在這個誘導(dǎo)過程中毛白楊接收了脅迫信號，對抗?jié)儾』蜻M行調(diào)控。P450可以通過催化合成與抗病相關(guān)的次生代謝物[14]（如木質(zhì)素和植保素），進而產(chǎn)生與病原菌誘導(dǎo)和抗?jié)儾∠嚓P(guān)的基因或物質(zhì)。與病程相關(guān)的另一個重要的蛋白-幾丁質(zhì)酶與植物抗病原微生物有關(guān)[15]。幾丁質(zhì)酶能夠毀壞病原真菌細(xì)胞壁新沉積的物質(zhì)，以至病原真菌死亡，并刺激了寄主的抗病反應(yīng)，使寄主做出相應(yīng)的防衛(wèi)反應(yīng)。該研究中CXY0415屬于此類蛋白。幾丁質(zhì)酶還可以與β1，3葡聚糖酶協(xié)同作用，激發(fā)植物多種抗病反應(yīng)，誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)反應(yīng)的產(chǎn)生[16]。該研究中CXY1313屬于此類，其表達水平一直處于上升趨勢，說明當(dāng)潰瘍病菌侵染毛白楊樹皮時，β1，3葡聚糖酶與幾丁質(zhì)酶這2種酶共同作用，發(fā)揮了對病原菌的抵抗，抑制了病原菌的生長。

肌動蛋白（Actin）是真核生物中一種重要的蛋白質(zhì)，大量積累在附著胞形成處，可以阻止病原菌侵入[17-18]。該研究中肌動蛋白因子7 （ADF7）（CXY0112）在初始階段表達水平很低，誘導(dǎo)48 h后表達逐漸增加，144 h達到最高，是初始90倍，大量積累，以更好地抵制病原菌侵入。鋅指蛋白（CXY1421）屬于細(xì)胞信號傳遞基因，可以將潰瘍病菌的誘導(dǎo)信號傳遞給寄主毛白楊[19]；鈣信使（CXY0504）除了傳遞信號外，還參與并調(diào)節(jié)基因表達，增強Active oxygen的產(chǎn)生，更加有效抵抗外來病菌的入侵[20-21]。鋅指蛋白和Ca2+作為抗病反應(yīng)信號，在生物體內(nèi)是相輔相成、相互作用的，互相接受和傳遞信號。胡豆合酶（CXY0511）是吲哚生物堿合成途徑中注：a.CXY1313；b.CXY1446；c.CXY0504；d.CXY1804；e.CXY1421；f.CXY1727；g.CXY0112。

圖5實時熒光定量RT-PCR 結(jié)果重要的中間產(chǎn)物，也參與植物的防御反應(yīng)[22]。

植物蛋白酶抑制劑[23-24]已在西紅柿、農(nóng)作物大豆及栗屬植物中被發(fā)現(xiàn)，且防御功能廣泛存在。在毛白楊被潰瘍病菌誘導(dǎo)后，半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CXY1727）的表達持續(xù)升高，主要是抑制葉片中衰老基因的表達，間接延長了寄主毛白楊的壽命，抑制了病原菌的生長繁殖，反映了蛋白抑制劑在植物防御反應(yīng)中的功能；筆者還發(fā)現(xiàn)Kunitz TI3（CXY1446）抑制劑，在銹菌侵染顫楊和雜交楊中寄主表現(xiàn)出對銹菌的抗性[25-26]。隨著潰瘍病菌侵入時間的增長，此抑制劑的表達量也迅速增加。

綜上所述，抑制差減雜交技術(shù)是一種高通量檢測基因差異表達的方法。該研究獲得了一些防御的候選基因，為今后研究楊樹與潰瘍病抗性提供分子依據(jù)，為揭示此類病害發(fā)生的機理和病菌的侵染機制具有重要的意義。

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