梁萌萌，薛潔，安榮，武運(yùn)，趙彩云，王德良

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊，830000)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)3(北京龍徽釀酒有限公司，北京，100143)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate;ethyl urethane;carbamic acid ethyl ester，簡稱為EC)，又稱為尿烷，是煙草葉及香煙的天然成分，也是發(fā)酵食品(如面包:酸牛奶、乳酪、醬油等)和酒精飲料(如葡萄酒、蘋果酒、中國黃酒和日本清酒等)的副產(chǎn)物，食品中含量非常低，一般在 ng/L到 mg/L之間［1－3］。20世紀(jì)40年代，Nettleship證明了EC具有致癌作用，可引起肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等?，F(xiàn)今EC被廣泛用于工業(yè)涂料及動物麻醉［4］。人體攝取氨基甲酸乙酯主要是通過飲用酒精飲料。調(diào)查顯示，如果人飲用氨基甲酸乙酯含量超過30 μg/L的酒［5］，那么患癌的機(jī)率會大大增加。

葡萄酒中EC是由前體物質(zhì)(尿素、瓜氨酸等氨甲酰類物質(zhì))和乙醇自發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生的，尿素和瓜氨酸是通過酵母的尿素循環(huán)途徑和蘋果酸-乳酸菌的精氨酸脫亞氨基酶途徑(簡稱ADI途徑)代謝產(chǎn)生，其含量與葡萄汁或葡萄酒中精氨酸含量密切相關(guān)［6－7］。另外(NH4)2HPO4也是影響葡萄酒中EC含量的因素［9］。

精氨酸是葡萄汁中含量豐富且酵母可以利用的氨基酸。葡萄在栽培期間會噴灑尿素，而為了避免葡萄酒發(fā)酵時出現(xiàn)遲緩或停止現(xiàn)象，生產(chǎn)者會在發(fā)酵前添加氨鹽。要控制葡萄酒中EC含量，了解前體物與EC間的量化關(guān)系以及它在葡萄汁中的最高限量非常重要。本研究分析了葡萄汁中精氨酸、尿素、瓜氨酸和(NH4)2HPO4對葡萄酒發(fā)酵過程中EC含量的影響，對從原料方面降低葡萄酒中的EC含量，提高葡萄酒的產(chǎn)品質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 模擬葡萄汁

儲液A:在375 mL蒸餾水中加入葡萄糖100 g，果糖100 g，定溶至500 mL;儲液B:在250 mL蒸餾水中加入 L-酒石酸6 g，L-蘋果酸3 g，檸檬酸0.5 g;儲液C:在250 mL蒸餾水中加入無氨基氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基1.7 g，肌醇6 mg，CaO 0.2 g，L-脯氨酸1 g，色氨酸0.1 g;將儲液A、B、C混合后調(diào)節(jié)pH值為3.3。

酵母菌D254、乳酸菌VP41:由上海杰兔工貿(mào)有限公司提供;精氨酸、瓜氨酸:色譜純，由百靈威公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀:美國PerkinElmer公司;安捷倫DBFFAP毛細(xì)管色譜柱(60 m ×0.25 mm×0.25 μm);strata FL-PR Florisil固相萃取柱:購于上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 主要化學(xué)試劑

氨基甲酸乙酯(EC)(純度＞99%)、內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丙酯(nPC)(純度＞98%):Sigma公司、丙酮(色譜純)、二氯甲烷(分析純)。

1.2 分析方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取0.100 0 g EC于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成1 000 mg/L的儲備液;再移取0.25 mL儲備液至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成10 mg/L的EC工作液。

稱取0.100 0 g nBC(內(nèi)標(biāo))于100 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成1 000 mg/L的儲備液;再移取0.25 mL儲備液至25 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成10 mg/L的nBC工作液。

1.2.2 樣品前處理

移取0.25 mL配制好的 nBC內(nèi)標(biāo)工作液于25 mL容量瓶中，用酒樣定容后混勻。取10 mL的正己烷于固相萃取柱上活化。

移取0.5 mL制備好的酒樣于固相萃取柱上，靜置5～10 min使酒樣充分吸附后，緩慢過柱至干，流速為5滴/min左右，棄去流出液。

用2 mL的正己烷洗柱，棄去流出液。再用10 mL二氯甲烷進(jìn)行洗脫，并用頂空瓶收集洗脫液，直至洗脫液流干。最后將收集液用氮吹儀氮吹至0.5 mL，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，待進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜-質(zhì)譜條件

升溫程序:柱初始溫度 60℃，保留 5 min，以4℃/min升溫速率至150℃，保留2 min，再以8℃/min升溫速率至222℃，保留2 min。

進(jìn)樣口溫度:260℃;傳輸線溫度:240℃;載氣:氦氣(99.999%);流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL。不分流進(jìn)樣，2 min后，打開分流出口，分流流量30 mL/min。

1.2.4 樣品檢測

使用 EC工作液分別用二氯甲烷制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L 的 EC 溶液，加入內(nèi)標(biāo)，使其濃度均為0.4 mg/L nPC。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將處理好的試樣，加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)樣分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣中EC含量。

1.2.5 精氨酸的測定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色譜法［10］。

1.2.6 尿素的測定方法

采用高效液相-熒光檢測器法［11］。

1.3 工藝流程

根據(jù)模擬葡萄汁配方配制葡萄汁，接種酵母菌，接種量是0.8‰，放入20℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酒精發(fā)酵5 d，酒精發(fā)酵結(jié)束后，用濾紙過濾酒樣，接種乳酸菌，接種量是0.05‰，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，發(fā)酵時間是30 d，發(fā)酵結(jié)束后，用濾紙過濾分離酒樣，裝瓶儲存。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在模擬葡萄汁中，分別添加不同濃度的精氨酸、尿素、瓜氨酸、(NH4)2HPO4，分析發(fā)酵過程中尿素和EC含量的變化。所有試驗(yàn)處理均設(shè)3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄汁中精氨酸含量對葡萄酒中EC含量的影響

精氨酸作為重要的前體物質(zhì)，在葡萄汁中的含量影響發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中EC的含量。本實(shí)驗(yàn)研究了7種不同含量的葡萄汁(見表1)在發(fā)酵過程及發(fā)酵后精氨酸、尿素和EC含量的變化，結(jié)果如圖1、圖2所示。

表1 發(fā)酵前葡萄汁中精氨酸的添加量Table 1 The additive amount of argnine in grape juice before ferment

圖1 酒精發(fā)酵過程中精氨酸含量變化Fig.1 The changes of the argnine content during alcoholic fermentation

圖1和圖2結(jié)果顯示，無論葡萄汁中初始精氨酸含量的高低，在整個發(fā)酵過程中精氨酸均呈現(xiàn)顯著的下降趨勢，發(fā)酵前2天降低幅度最大，葡萄汁中初始精氨酸含量越高，發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中的精氨酸含量也越高。尿素的變化與精氨酸相反，整個發(fā)酵過程中含量呈增加趨勢，但圖2也顯示尿素的轉(zhuǎn)化速度d［Urea］/dt在整個發(fā)酵過程中是不同的，其中發(fā)酵前3天增加速率最大，隨后逐漸降低，這主要與部分尿素形成EC有關(guān)。

葡萄汁中初始精氨酸含量越高，發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中的尿素含量也越高，關(guān)系如圖3所示。

圖2 酒精發(fā)酵過程中尿素的含量變化Fig.2 The changes of the urea content during alcoholic fermentation

圖3 葡萄汁初始精氨酸濃度與發(fā)酵后葡萄酒中的尿素含量間的關(guān)系Fig.3 The relationship between argnine concentration in grape juice and the urea content in wine after fermentation

葡萄汁中添加精氨酸，則發(fā)酵過程中尿素會大量積累，雖然后期會有一些尿素被利用，但發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中還剩余大量的尿素，尿素大量的積累階段與酵母快速繁殖階段基本一致。而且葡萄汁中初始精氨酸含量和發(fā)酵結(jié)束后尿素含量間呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，兩者間的關(guān)系為:［Urea］=0.018 3［Arg］+1.827 9，斜率為精氨酸-尿素轉(zhuǎn)化率，該方程中存在正截距，也說明了除精氨酸外，發(fā)酵過程中還有其他物質(zhì)參與到尿素的形成中。

根據(jù)資料報(bào)道，葡萄酒中EC含量與尿素濃度間呈正比例關(guān)系［15］，而精氨酸又直接影響尿素的含量，本研究分析了酒精發(fā)酵后精氨酸含量與EC生成量間的關(guān)系(圖4)，結(jié)果表明EC與精氨酸含量間的關(guān)系為:［EC］=0.003 6［Arg］+5.984 9，兩者間的相關(guān)系數(shù)為0.985 2，呈顯著的相關(guān)關(guān)系。根據(jù)分析結(jié)果，未添加精氨酸的樣品中EC含量為2.05 μg/L，低于方程的正截距5.984 9，說明了精氨酸代謝產(chǎn)生尿素是EC產(chǎn)生的途徑之一，葡萄酒酒精發(fā)酵過程中也存在其他EC形成路徑。

圖4 葡萄汁初始精氨酸濃度與酒精發(fā)酵后葡萄酒中EC含量間的關(guān)系Fig.4 The relationship between argnine concentration in grape juice and the ethyl carbamate content in wine after fermentation

蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中，蘋果酸乳酸菌通過精氨酸脫亞氨基酶途徑(ADI途徑)產(chǎn)生的瓜氨酸是葡萄酒EC形成的另一個重要前體物質(zhì)，在模式葡萄汁中，精氨酸可以被乳酸菌代謝，隨后瓜氨酸被乳酸菌分泌到介質(zhì)中，兩者之間的關(guān)系為:瓜氨酸分泌率=0.032×精氨酸降解率+0.005，r=0.093，因此精氨酸含量也影響ADI途徑EC的生成量，研究分析了酒精發(fā)酵和蘋果酸乳酸發(fā)酵后葡萄酒中EC的含量，結(jié)果如表2所示。

表2 初始精氨酸含量不同的葡萄汁酒精發(fā)酵和MLF后EC的含量Table 2 The content of ethyl carbamate after alcoholic fermentation and MLF in grape juice which have different content of argnine

表2結(jié)果表明，在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中，葡萄酒中EC含量明顯增加，增加幅度大于酒精發(fā)酵過程中EC的產(chǎn)生量，這主要是由于在此過程中不僅存在瓜氨酸與乙醇反應(yīng)生成EC的過程，也存在酒精發(fā)酵后尿素與乙醇反應(yīng)生成EC的過程，這兩個過程均受葡萄汁中初始精氨酸含量的影響。葡萄汁中初始精氨酸含量與MLF后EC產(chǎn)生量之間的關(guān)系為:［EC］=0.0181［Arg］+10.7，相關(guān)系數(shù)為0.963 6，呈顯著的相關(guān)關(guān)系，根據(jù)該方程，如果已知發(fā)酵前葡萄汁中的精氨酸含量，就可推算出發(fā)酵后葡萄酒中的EC含量。而且當(dāng)精氨酸含量為1 000、1 500和2 000 mg/L時，發(fā)酵后的EC含量達(dá)到了32.72、38.08和44.04 μg/L，超出了歐盟現(xiàn)有的限量標(biāo)準(zhǔn)，因此發(fā)酵前應(yīng)通過控制酵母營養(yǎng)鹽的添加量或澄清處理等措施控制葡萄汁中的精氨酸含量。

2.2 葡萄汁中的尿素和瓜氨酸含量對葡萄酒中EC含量的影響

早在1988年，Ough［8］就指出葡萄酒中EC形成的主要前體物質(zhì)是尿素和瓜氨酸［12－14］，但尿素、瓜氨酸含量與EC生成量間的關(guān)系如何，目前仍無研究報(bào)道。本試驗(yàn)在發(fā)酵前的模擬葡萄汁中分別添加了不同濃度的尿素和瓜氨酸，研究發(fā)酵過程中尿素、EC的變化趨勢，結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 不同尿素含量的葡萄汁發(fā)酵過程中EC的變化趨勢Fig.5 The variation trend of EC during fermentation in grape juice which have different content of urea

圖6 不同瓜氨酸含量的葡萄汁發(fā)酵過程中EC的變化趨勢Fig.6 The variation trend of EC during fermentation in grape juice which have different content of citrulline

在葡萄汁發(fā)酵前分別添加尿素、瓜氨酸，發(fā)酵過程中兩者含量呈均下降趨勢，而對應(yīng)EC含量不斷增加。圖5顯示無論初始尿素含量的高低，發(fā)酵前3天，EC增加幅度最為明顯，這與尿素的變化趨勢基本一致，在一定程度上也說明了尿素是EC的前體物質(zhì)。未添加尿素的葡萄汁，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的EC含量極少;葡萄汁初始尿素含量越高，產(chǎn)生的EC也就越多。而初始瓜氨酸含量不同的葡萄汁，整體變化趨勢與尿素基本一致，但兩者也存在明顯差異，圖形顯示尿素與乙醇間的反應(yīng)主要發(fā)生在酒精發(fā)酵過程，而瓜氨酸與乙醇的反應(yīng)卻主要發(fā)生在MLF過程中，這可能是由于尿素、瓜氨酸與EC間的反應(yīng)存在競爭作用，尿素更容易與EC發(fā)生反應(yīng)。

由于葡萄酒發(fā)酵過程中同時存在精氨酸脫羧生成尿素和尿素與乙醇反應(yīng)生成EC兩個過程，2.1結(jié)果表明精氨酸與發(fā)酵結(jié)束后EC的含量呈線性相關(guān)，則推測尿素與EC含量間也應(yīng)該存在線性關(guān)系，圖7、圖8結(jié)果也正好如此，尿素與EC含量間的關(guān)系為［EC］=0.826 5［Urea］+1.833 1，平均 EC 產(chǎn)生量為1.017 2 μg/mg尿素，而瓜氨酸與間的關(guān)系為［EC］=0.1977［Citrulline］+6.659 2，平均 EC 產(chǎn)生量為0.305 5 μg/mg瓜氨酸。與精氨酸對EC影響的反應(yīng)系數(shù)0.018 1相比，系數(shù)為0.826 5的尿素影響更為顯著，因此在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)禁止將尿素作為酵母營養(yǎng)樣直接添加到葡萄汁中。

圖7 葡萄汁中初始尿素含量與EC產(chǎn)生量之間的關(guān)系Fig.7 The relationship between urea content in grape juice and the output of urea ethyl

圖8 葡萄汁中初始瓜氨酸含量與EC產(chǎn)生量之間的關(guān)系Fig.8 The relationship between citrulline content in grape juice and the output of urea ethyl

2.3 葡萄汁中的(NH4)2HPO4含量對葡萄酒中EC含量的影響

葡萄酒在起酵階段，酵母對含氮物質(zhì)的需求量增加，因此生產(chǎn)中經(jīng)常會添加一些氮源，本研究常用氮源(NH4)2HPO4對葡萄酒中EC含量的影響，其濃度分別為0、100、150、200、250 和300 mg/L，研究結(jié)果如表3所示。

表3 初始(NH4)2HPO4含量不同的葡萄汁酒精發(fā)酵和MLF后EC的含量Table 3 The content of ethyl carbamate after alcoholic fermentation and MLF in grape juice which have different content of(NH4)2HPO4

從表3數(shù)據(jù)可知，添加(NH4)2HPO4含量增加時，EC含量變化沒有規(guī)律性，說明(NH4)2HPO4不直接參與EC的生成，主要是通過影響酵母的活性影響EC的生成量。雖然與精氨酸、尿素相比，(NH4)2HPO4影響非常有限，但從總的變化趨勢來看，隨著添加量的增加，EC含量也在增加，因此生產(chǎn)中還是應(yīng)控制氨鹽的添加量。

3 結(jié)論

(1)葡萄汁中的精氨酸通過影響發(fā)酵過程中尿素和瓜氨酸的含量而影響EC的產(chǎn)生量，精氨酸含量和發(fā)酵結(jié)束后尿素含量間呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，兩者間的關(guān)系為:［Urea］=0.018 3［Arg］+1.827 9;精氨酸和瓜氨酸之間的關(guān)系為:瓜氨酸產(chǎn)生率 =0.032×精氨酸降解率+0.005，r=0.093。

(2)葡萄汁中精氨酸含量直接影響發(fā)酵結(jié)束后的EC產(chǎn)生量，兩者之間的關(guān)系為:［EC］={0.018 1}［Arg］+10.7，相關(guān)系數(shù)為0.963 6，根據(jù)該方程，如果已知發(fā)酵前葡萄汁中的精氨酸含量，即可大致推算出發(fā)酵后葡萄酒中的EC含量。

(3)當(dāng)葡萄汁中精氨酸含量為大于1 000 mg/L時，發(fā)酵后的EC含量超出了歐盟現(xiàn)有的限量標(biāo)準(zhǔn)30 μg/L，因此發(fā)酵前應(yīng)通過控制酵母營養(yǎng)鹽的添加量或澄清處理等措施控制葡萄汁中的精氨酸含量。

(4)尿素和瓜氨酸直接影響葡萄酒中的EC含量，兩者相比，尿素的影響更為明顯，本實(shí)驗(yàn)中平均EC產(chǎn)生量分別為1.017 2 μg/mg尿素和0.305 5 μg/mg瓜氨酸，因此生產(chǎn)中應(yīng)禁止將尿素作為營養(yǎng)鹽直接添加到葡萄汁中。

(5)(NH4)2HPO4對EC的影響沒有規(guī)律，而且影響幅度也很有限，但總的是呈增加趨勢。

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