吳宏富，黃衛(wèi)平，劉放

(1.浙江省慶元縣中醫(yī)院藥劑科，慶元 323800;2.浙江醫(yī)學高等?？茖W校，杭州 310053;3.浙江省醫(yī)學科學院藥物研究所，杭州 310013)

高效液相色譜法測定葉酸片的含量與有關(guān)物質(zhì)

吳宏富1，黃衛(wèi)平2，劉放3

(1.浙江省慶元縣中醫(yī)院藥劑科，慶元 323800;2.浙江醫(yī)學高等?？茖W校，杭州 310053;3.浙江省醫(yī)學科學院藥物研究所，杭州 310013)

目的 建立測定葉酸片含量及有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜(HPLC)法。方法采用Hypersil C18(4.6 mm× 250 mm,5 μm)色譜柱,流動相磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀6.8 g與0.1 mol·L-1氫氧化鉀溶液70 mL,加水稀釋至800 mL,調(diào)節(jié)pH至6.3,加甲醇80 mL,用水稀釋成1 000 mL為流動相),檢測波長254 nm。結(jié)果葉酸在19.80～277.24 μg·mL-1濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9,n=7),平均回收率98.65%～98.95%,RSD= 0.20%～0.60%(n=9)。葉酸及其有關(guān)物質(zhì)得到基線分離,方法最低檢測限0.6 ng,控制總雜質(zhì)量不得超過2.0%。結(jié)論該方法測定葉酸片的含量及有關(guān)物質(zhì),方法簡便、快速、結(jié)果準確,專屬性好,適用于葉酸片及其制劑的質(zhì)量控制。

葉酸；有關(guān)物質(zhì)；質(zhì)量控制；色譜法,高效液相,反相

葉酸(folic acid)是一種抗貧血藥物,亦稱維生素M或維生素BC,與人體重要的生化過程密切相關(guān),直接影響核酸的合成及氨基酸代謝,對細胞分裂、增殖和組織生長具有極其重要的作用,婦女懷孕早期適量增補葉酸可以降低神經(jīng)管畸形的發(fā)生[1]。葉酸已成為一種集預(yù)防、治療和保健于一身的多功能藥物而越來越受到重視。有關(guān)葉酸分析方法的報道有紫外分光光度法[2]、一階導(dǎo)數(shù)光譜法[3]、流動注射化學發(fā)光法[4]以及高效液相色譜法等,其中以高效液相色譜法最常用。為了控制葉酸制劑的質(zhì)量,筆者者參考有關(guān)文獻[5-11],建立了高效液相色譜法測定葉酸片的含量和有關(guān)物質(zhì),現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-10ATvp高效液相色譜儀;SPD-10A紫外檢測器,N-2000雙通道色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所,浙江大學智能信息工程有限公司);TU-1800紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司),Sartorius BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),YB-2型澄明度檢測儀(天津大學精密儀器廠),SB-2200超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司),PHS-9V型酸度計(杭州華光無線電廠),101-1型電熱鼓風干燥箱(上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司)。

1.2 試藥 葉酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:100074-200912,HPLC法測定含量為90.6%,UV法測得含量為91.7%)。葉酸片(北京北大藥業(yè)有限公司,商品名:斯利安,規(guī)格:0.4 mg,批號:S080203, S090413),葉酸片(浙江省醫(yī)學科學院藥物研究所,批號:E00910,E01010,E01110,規(guī)格:0.4 mg),甲醇(上海陸都實業(yè)有限公司,色譜純),磷酸二氫鉀(上?；瘜W試劑二廠,分析純),氫氧化鉀(浙江杭州蕭山化學試劑廠,分析純),磷酸(建德化工廠,分析純),水為雙蒸餾水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 葉酸紫外吸收光譜 取葉酸對照品約10 mg,置50 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液30 mL,溶解后用水稀釋至刻度,搖勻,精密量取1 mL置20 mL棕色量瓶,用水稀釋至刻度,搖勻,制成每毫升約含葉酸10 μg的溶液,在波長200～500 nm范圍內(nèi)進行全掃描,結(jié)果葉酸在254 nm波長處有最大吸收(圖1)。

圖1 葉酸紫外吸收光譜

2.2 色譜條件 色譜柱:Hypersil C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm),流動相:磷酸鹽緩沖液(pH6.3)(取磷酸二氫鉀6.8 g與0.1 mol·L-1氫氧化鉀溶液70 mL,加水稀釋至800 mL溶解,調(diào)節(jié)pH至6.3,加甲醇80mL,用水稀釋成1000mL),流速: 1.0 mL·min-1,檢測波長:254 nm,柱溫:室溫,進樣量:20 μL。靈敏度:0.05 AUFS,理論板數(shù)以葉酸峰計不得低于2 000。

2.3 含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 取葉酸對照品約20 mg精密稱定至50 mL棕色量瓶,加入5%氨水30 mL助溶,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,即得0.400 mg·mL-1對照品溶液;精密吸取0.5,1.0,2.0,4.0,5.0,6.0和7.0 mL,分別置于7只10 mL棕色量瓶,用水稀釋至刻度,搖勻。精密量取10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖和峰面積,以葉酸濃度(C,μg·mL-1)對相應(yīng)峰面積(A)進行線性回歸,回歸方程為:A=1 986.78C+1 084.47,r=0.999 9(n=7),結(jié)果葉酸濃度在19.80～277.24 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 加樣回收實驗 分別取葉酸對照品約16,20, 24 mg精密稱定置于100 mL棕色量瓶,各3份,按處方比例加入混合輔料,加0.5%氨溶液約60 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為樣品供試品溶液。另配制含葉酸200 μg·mL-1對照品溶液,精密量取供試品溶液與對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖和峰面積,按外標法以峰面積計算葉酸加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 葉酸回收實驗結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性實驗 取本品50片,精密稱定,研細,取適量(相當于葉酸5 mg),精密稱定置25 mL棕色量瓶(平行操作6份),加0.5%氨溶液約15 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液,精密量取10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖;另取上述含葉酸200 μg·mL-1對照品溶液,同法測定。按外標法以峰面積計算,結(jié)果葉酸平均含量為99.38%,RSD= 0.57%(n=6)。

2.3.4 供試品溶液穩(wěn)定性 取“2.3.3”項供試品溶液,分別于0,1,2,4,8 h,精密量取10 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖和峰面積,結(jié)果樣品供試液在8 h內(nèi)所測得的圖譜峰面積的RSD=0.29%(n=5),表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 樣品的含量測定 取葉酸2批,按“2.3.3”項操作,制備供試品溶液和對照品溶液,依法測定,結(jié)果見表2。

2.4 樣品有關(guān)物質(zhì)檢查

2.4.1 方法專屬性實驗 取葉酸片50片,精密稱定,研細,取適量(相當于葉酸20 mg),精密稱定置50 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液約30 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液(含葉酸約為400 μg·mL-1)備用。

2.4.1.1 未破壞供試品溶液的制備 取上述續(xù)濾液5 mL,置10 mL棕色量瓶,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(含葉酸約為200 μg·mL-1)。

2.4.1.2 強酸破壞供試品溶液的制備 取上述續(xù)濾液5 mL,置10 mL棕色量瓶,加1 mol·L-1鹽酸1 mL,放置4 h,再加1 mol·L-1氫氧化鈉1 mL中和,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(含葉酸約為200 μg·mL-1)。

2.4.1.3 強堿破壞供試品溶液的制備 取上述續(xù)濾液5 mL,置10 mL棕色量瓶,加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL,放置4 h,再加1 mol·L-1鹽酸1 mL中和,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(含葉酸約為200 μg·mL-1)。

2.4.1.4 氧化破壞供試品溶液的制備 取上述續(xù)濾液5 mL,置10 mL棕色量瓶,加30%過氧化氫,放置1 h,用水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(含葉酸約為200 μg·mL-1)。

2.4.1.5 高溫破壞供試品溶液的制備 取葉酸片20片,精密稱定,置烘箱中于90℃中放置12 h,取出放冷后,研細,取適量(相當于葉酸5 mg),精密稱定置25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液約15 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液(含葉酸約為200 μg·mL-1)。

2.4.1.6 強光破壞供試品溶液的制備 取葉酸片20片,精密稱定,置澄明度檢測儀中,于照度(4 500±500)Lx強光下照射24 h,取出后,研細,取適量(相當于葉酸5 mg),精密稱定置25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液約15 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液(含葉酸約為200 μg·mL-1)。

2.4.1.7 混合輔料供試品溶液的制備 取混合輔料適量,置25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液約15 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,作為供試品溶液。

精密量取上述供試品溶液10 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。實驗結(jié)果表明供試品經(jīng)上述劇烈條件破壞后產(chǎn)生的雜質(zhì)峰、降解產(chǎn)物峰與葉酸峰均能達到較好的分離,分離度(R)均＞1.5;混合輔料在葉酸主峰位置及附近均不出峰,不干擾分析測定。

2.4.2 定量限與檢測限 取葉酸對照品約5 mg精密稱定,置于25 mL棕色量瓶,加0.5%氨溶液約15 mL,置熱水浴中加熱20 min,時時振搖使葉酸溶解,放冷,用水稀釋至刻度,搖勻。制成濃度為200 μg·mL-1對照品溶液;精密量取1 mL,置10 mL棕色量瓶,用水稀釋至刻度,搖勻。制成濃度為20 μg·mL-1的對照品溶液;依次類推制成濃度為0.2和0.06 μg·mL-1的對照品溶液;量取不同體積分別進樣,當信噪比(S/N)≥10和S/N≥3時,葉酸定量限為2 ng,檢測限為0.6 ng。

2.4.3 樣品有關(guān)物質(zhì)的測定 采用自身對照法。取“2.3.5”項供試品溶液作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 mL,置50 mL棕色量瓶,用水稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。精密量取對照溶液10 μL注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使對照溶液的主峰高為滿量程的20%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各10 μL,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對照溶液的主峰面積(2. 0%),結(jié)果見表2。

表2 葉酸片含量和有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果 %,n=3

3 討論

3.1 波長的選擇 根據(jù)“2.1”項實驗結(jié)果,葉酸在波長254 nm處有最大吸收,與文獻[5-7]報道相符,輔料在254 nm波長處沒有吸收,故實驗采用254 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇 采用高效液相色譜法測定葉酸類藥物含量的報道較多[5-11],所用流動相有磷酸鹽緩沖液(pH6.3)(取磷酸二氫鉀6.8 g與0.1 mol·L-1氫氧化鉀溶液70 mL,加水稀釋至800 mL溶解,調(diào)節(jié)pH至6.3,加甲醇80 mL,用水稀釋成1 000 mL)[5-6],以磷酸二氫鉀6.8 g與0.1 mol·L-1氫氧化鉀水溶液70 mL,稀釋約850 mL,用氫氧化鉀稀溶液調(diào)節(jié)pH至6.3±0.1,加甲醇130 mL,水稀釋成1 000 mL的溶液[7],甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖液(11∶89, pH5.4)[8],甲醇∶水(含2%醋酸、0.1%辛烷磺酸鈉、0.2%乙二胺,25∶75[9],甲醇∶水=30∶70[10],甲醇-水-冰醋酸(40∶60∶0.1)[11]等;參照葉酸片質(zhì)量標準(《中華人民共和國藥典》2010年版二部),本實驗采用以磷酸鹽緩沖液(pH6.3)(取磷酸二氫鉀6.8 g與0.1 mol·L-1氫氧化鉀溶液70 mL,加水稀釋至800 mL溶解,調(diào)節(jié)pH至6.3,加甲醇80 mL,用水稀釋成1 000 mL)流動相。

3.3 供試品溶液穩(wěn)定性 葉酸在水和酸性條件下具有熱不穩(wěn)定性和光不穩(wěn)定性,而在稀堿條件下易溶且穩(wěn)定性好,因此在實驗中用0.5%氨溶液溶解樣品,且操作過程需要避光。

3.4 方法專屬性 方法專屬性實驗顯示,本品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光等破壞實驗,產(chǎn)生的雜質(zhì)峰和降解產(chǎn)物峰均能與主峰達到基線分離,說明該色譜條件可用于葉酸片的有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物的檢查。

3.5 方法優(yōu)點 目前,《中華人民共和國藥典》2010年版[5]葉酸及其制劑葉酸片質(zhì)量標準項下尚無有關(guān)物質(zhì)測定方法。筆者在本實驗中經(jīng)過系列方法學研究,采用高效液相色譜法-紫外檢測器測定葉酸片的含量和有關(guān)物質(zhì),方法簡便易行,準確度高,專屬性好,易于普及,可作為葉酸及其制劑的質(zhì)量控制方法。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.034

R977.2;R927.1

A

1004-0781(2014)03-0389-04

2013-07-06

2013-08-20

吳宏富(1972-),男,浙江慶元人,副主任藥師,主要從事醫(yī)院藥學工作。E-mail：qywhf@yesh.net。