鄒 宇，胡立明，胡文忠，* ，何煜波，劉程惠

(1.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600;2.空軍勤務學院航空軍需系，江蘇徐州221006)

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)廣泛分布于自然界中，存在于肉類、乳制品、蛋類、海產(chǎn)品和蔬菜等大多數(shù)食品中［1－2］。單增李斯特菌是人畜共患病的病原菌，也是一種腐生菌，在某些食物(主要是肉類和乳制品)中易于生長繁殖，能引起嚴重的食物中毒，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎等［3－4］。該菌在 4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一［5］。牛奶營養(yǎng)豐富且配比合理，易受到單增李斯特菌的污染［6］，因此，研究單增李斯特菌在牛奶中的生長情況對保障食品安全性是十分必要的。

食品預測微生物學是一門在微生物學、數(shù)學和統(tǒng)計學基礎上建立起來的新學科［7－8］，通過建立數(shù)學預測模型，可定量分析不同環(huán)境條件(如溫度、濕度、含氧量等)下食品中病原菌和腐敗菌的數(shù)量，從而對食品中微生物的生長情況作出合理預測。

本實驗通過測定5、15、25和35℃條件下單增李斯特菌在牛奶中的細菌總數(shù)并擬合生長動力學曲線，進而建立牛奶中單增李斯特菌生長的初級模型和二級模型，為牛奶等食品在貯藏過程中對單增李斯特菌的預測和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單增李斯特菌 由遼寧省食源性病原性微生物快速檢測與安全控制中心提供;牛奶 市售純牛奶，購于大連本地超市;胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司。

MLS－3780高壓蒸汽滅菌器 三洋電機株式會社;海爾hrcj－1D超凈工作臺 青島海爾特種電器有限公司;DNP－9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司;海爾HYC－326A醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將35℃活化15h后處于對數(shù)生長期的單增李斯特菌接種于純牛奶(50mL牛奶/250mL三角瓶)中，使初始接種量達到3×103CFU/mL，考慮到牛奶常見貯藏溫度和建模均勻取值需要，將牛奶樣品分別放置于5、15、25和35℃恒溫冷藏箱和恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，根據(jù)實驗設計每隔一定時間取樣測定細菌總數(shù)。

1.2.2 細菌總數(shù)測定 無菌操作吸取樣品各5mL，分別放入裝有滅菌生理鹽水的三角瓶中，適當稀釋，涂布于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基表面，36℃培養(yǎng)24h，采用平板計數(shù)法測定各樣品中的細菌總數(shù)［9］。

1.2.3 生長動力學模型(初級模型)的建立 利用在5、15、25和35℃條件下測得的生長曲線實驗數(shù)據(jù)分別擬合 Gompertz 方程［10］、Logistic 方程［10－11］和 Hill方程［12］，建立相應的模型，并確定最優(yōu)的初級模型。

式中，t為時間，h;N(t)為t時的菌數(shù)，lg(CFU/mL);N0為初始菌數(shù)，lg(CFU/mL);a、b和 c為待定系數(shù)。

式中，t為時間，h;N(t)為t時的菌數(shù)，lg(CFU/mL);N0為初始菌數(shù)，lg(CFU/mL);a、b和 c為待定系數(shù)。

式中，t為時間，h;N(t)為t時的菌數(shù)，lg(CFU/mL);N0為初始菌數(shù)，lg(CFU/mL);a、b和 c為待定系數(shù)。

1.2.4 溫度對微生物影響的動力學模型(二級模型)的建立 利用最優(yōu)初級模型(Gompertz方程)中的實驗數(shù)據(jù)來建立溫度對單增李斯特菌影響的二級模型。二級模型采用Belehradek方程，是由Ratkowsky等［13］根據(jù)微生物在0～40℃條件下，最大生長速率或延滯時間倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的線性關系而提出的經(jīng)驗模型。

式中，T為溫度，℃;Vmax為溫度T時的最大生長速率，h－1;Lag為溫度 T 時的延滯時間，h;dV、dLag、TminV和TminLag均為待定系數(shù)，其中 TminV和 TminLag為假定的微生物生長的最低溫度，℃。

根據(jù)Gompertz方程可推導出［14］:最大生長速率:Vmax=ac/e;延滯時間:Lag=(b－1)/c;最大菌數(shù):Nmax=N0+a。

1.2.5 生長預測模型的驗證與可靠性評價 應用建立的單增李斯特菌生長動力學模型來求得20℃條件下預測值，與實測值進行比較，并采用偏差度和準確度來評價預測模型的可靠性［15］。

式中，N預測為生長模型的預測值，lg(CFU/mL);N實測為同一時間的實測值，lg(CFU/mL);n為實驗次數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結果為三次重復的平均值，采用SAS 8.2進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析，采用Statistica 6.0進行模型的擬合。

2 結果與分析

2.1 單增李斯特菌的生長動力學曲線和擬合的初級模型

將牛奶在5、15、25和35℃貯藏過程中得到的細菌總數(shù)值，分別采用Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程進行擬合，得到的生長曲線如圖1所示。

由表 1可知，在 5、15、25和 35℃ 條件下Gompertz方程擬合的模型 R2均大于同溫度下Logistic方程和Hill方程擬合的模型，且Gompertz方程擬合模型的標準誤差(SE)均小于其它兩種模型，這表明Gompertz方程擬合的模型更接近于真實值，因此選擇Gompertz方程作為單增李斯特菌在牛奶中的最優(yōu)初級模型，并以此為基礎建立二級模型。

2.2 溫度對單增李斯特菌影響的動力學模型(二級模型)

表2為不同溫度條件下Gompertz方程擬合的生長動力學模型的各項參數(shù)。隨著溫度的升高，最大菌數(shù)(Nmax)和最大生長速率(Vmax)逐漸變大，而延滯時間(Lag)則逐漸縮短。最大生長速率或延滯時間倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的線性關系，需要采用Belehradek方程進行描述。

由圖2可知，最大生長速率(Vmax)和延滯時間(Lag)倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的良好的線性關系，模型的 R2分別為 0.9721和0.9747，這表明Belehradek方程更好的描述了不同溫度變化對單增李斯特菌生長的影響。溫度與最大生長速率和延滯時間的Belehradek方程分別為:

圖1 單增李斯特菌在不同溫度條件下的生長曲線和動力學模型Fig.1 Growth curves and kinetic models of L.monocytogenes at different temperature

表1 不同溫度條件下單增李斯特菌在牛奶中的生長動力學模型Table 1 Growth kinetics models of L.monocytogenes in milk at different temperatures

表2 單增李斯特菌在牛奶中生長動力學模型的參數(shù)Table 2 Parameters of growth kinetics model of L.monocytogenes in milk

圖2 溫度與最大生長速度和延滯時間的關系Fig.2 Relationship between temperature and Vmaxor Lag

由最大生長速度和延滯時間的實測值與預測值的殘差分析(表3)可知，殘差值均小于0.06，這表明Belehradek方程建立的二級模型是可信的。

表3 溫度與最大生長速度和延滯時間平方根模型的殘差分析Table 3 Residuals analysis of temperature and(Vmax)1/2or(1/Lag)1/2

表4 20℃條件下單增李斯特菌生長預測模型的驗證與分析Table 4 Verification and analysis of growth kinetics prediction model of L.monocytogenes at 20℃

2.3 單增李斯特菌生長預測模型的驗證與可靠性評價

為驗證建立的生長預測模型的有效性和可靠性，根據(jù)預測模型構建20℃條件下單增李斯特菌的生長動力學方程，比較同一時間的預測值和實測值，并分析預測模型的偏差度和準確度。采用李苗云等［9］和李除夕等［15］最大菌數(shù)的計算方法，20℃ 條件下最大菌數(shù)(Nmax)以15℃和25℃條件下最大菌數(shù)對數(shù)值的平均值為判斷指標，由二級模型(Belehradek方程)計算出20℃時的最大生長速率(Vmax)和延滯時間(Lag)，帶入修正后的Gompertz方程，求得20℃條件下單增李斯特菌的生長預測模型(初級模型)為:

由表4可知，20℃條件下生長預測模型的殘差值均小于0.2，偏差度為1.04，準確度為1.13，小于李除夕等建立的豆腐中庫特氏菌生長預測模型的偏差度和準確度［15］，表明建立的模型有效且可靠，在已知初始菌數(shù)(N0)的情況下，可以快速預測5～35℃條件下不同貯藏時間點時單增李斯特菌在牛奶中的生長情況。

3 結論

比較了5、15、25和35℃條件下Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程對單增李斯特菌在牛奶中生長動力學曲線的擬合情況，確定Gompertz方程為最優(yōu)的初級模型。在此基礎上，采用Belehradek方程建立了相應的二級模型。驗證實驗結果為:20℃條件下單增李斯特菌細菌總數(shù)的預測值和真實值的殘差均小于0.2，模型的偏差度為1.04，準確度為1.13，這表明建立的模型有效且可靠。在已知初始菌數(shù)的情況下，可以根據(jù)模型快速預測5～35℃條件下不同貯藏時間點時單增李斯特菌在牛奶中的生長情況。本研究結果對預測和監(jiān)控食源性致病菌在食物中的生長和繁殖，保證食品的安全性等方面具有參考價值。

［1］Jadhav S，Bhave M，Palombo EA.Methods used for the detection and subtyping of Listeria monocytogenes［J］.Journal of Microbiological Methods，2012，88:327－341.

［2］Donaldson JR，Nanduri B，Pittman JR，et al.Proteomic expression profiles of virulent and avirulent strains of Listeria monocytogenesisolated from macrophages［J］.Journalof Proteomics，2011，74:1906－1917.

［3］Shahbana SA，Manjulab N，Siddiqui S.Listeria septicaemia following insertion of a dynamic hip screw:A case report and literature review［J］.International Journal of Surgery Case Reports，2012，3:448－450.

［4］Arif M，Rajpoot NM，Nattkemper TW，et al.Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion［J］.Journal of Biotechnology，2012，154:76－83.

［5］丁甜，董慶利，相啟森，等.Listeria monocytogenes在經(jīng)高氧化還原電位酸性水處理的鮮食萵苣上預測模型的建立［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(3):87－90，94.

［6］Cava－Roda RM，Taboada A，Palop A，et al.Heat resistance of Listeria monocytogenes in semi－skim milk supplemented with vanillin［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，157(2):314－318.

［7］McMeekin T，Bowman J，McQuestin O，et al.The future of predictive microbiology:Strategic research，innovative applications and greatexpectations［J］.InternationalJournalofFood Microbiology，2008，128(1):2－9.

［8］Mertens L，Derlinden EV，Impe JFV.Comparing experimental design schemes in predictive food microbiology:Optimal parameter estimation of secondary models［J］.Journal of Food Engineering，2012，112:119－133.

［9］李苗云，孫靈霞，周光宏，等.冷卻豬肉不同貯藏溫度的貨架期預測模型［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2008，24(4):235－239.

［10］Zwietering MH，JongenburgerI，Rombouts FM，et al.Modeling of the bacterial growth curve［J］.Applied and Environmental Microbiology，1990，56(5):1875－1881.

［11］李博，滿朝新，趙鳳，等.原料乳中金黃色葡萄球菌生長預測模型的建立［J］.食品科學，2011，32(15):158－162.

［12］王懷記，王增珍.Hill模型及其在環(huán)境危險度評價中的應用［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2006，23(4):372－374.

［13］Ratkowsky DA，Olley J，McMeekin TA，et al.Relationship between temperature and growth rate of bacterial cultures［J］.Journal of Bacteriology，1982，149(1):1－5.

［14］劉超群，陳艷麗，王宏勛，等.冷鮮豬肉中熱殺索絲菌生長預測模型的建立與驗證［J］.食品科學，2010，31(18):86－89.

［15］李除夕，董明盛，陳曉紅，等.豆腐中庫特氏菌生長動力學模型和貨架期預測［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2009，25(1):82－86.