大鼠退變髓核腰交感神經(jīng)干注射對交感神經(jīng)干炎癥因子表達(dá)的影響

卞晶晶，唐元章，武百山，范 婷，倪家驤＊

（1.清華大學(xué)玉泉醫(yī)院麻醉科，北京100049；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院疼痛科，北京100053）

大鼠退變髓核腰交感神經(jīng)干注射對交感神經(jīng)干炎癥因子表達(dá)的影響

卞晶晶1，唐元章2，武百山2，范 婷1，倪家驤2＊

（1.清華大學(xué)玉泉醫(yī)院麻醉科，北京100049；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院疼痛科，北京100053）

目的觀察X線引導(dǎo)下大鼠退變髓核腰交感干注射對腰交感神經(jīng)干炎癥因子表達(dá)的影響。方法實(shí)驗(yàn)用雄性SD大鼠共72只，隨機(jī)分為三組：空白對照組、假手術(shù)組、髓核注射組。髓核注射組大鼠行X線下自體退變髓核懸液右側(cè)腰交感干注射，假手術(shù)組注射等劑量生理鹽水，空白對照組不做任何處理。注射后14天，取各組大鼠右側(cè)腰交感干行組織學(xué)觀察，并采用ELISA法定量分析炎性細(xì)胞因子IL－1β、IL－6和TNF－α表達(dá)變化。結(jié)果髓核注射組大鼠腰交感干組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤及血管腫脹、充血；ELISA檢測發(fā)現(xiàn)腰交感干IL－1β（20.1± 4.40pg／ml），IL－6（26.5±8.9pg／ml）及TNF－α（60.77±6.37pg／ml）蛋白含量比空白對照組IL－1β（8.02±1.31pg／ml），IL－6（10.30±1.43pg／ml），TNF－α（24.38±4.81pg／ml）及假手術(shù)組IL－1β（7.52±2.11pg／ml），IL－6（11.58± 2.56pg／ml），TNF－α（26.12±6.81pg／ml）表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論大鼠自體退變髓核導(dǎo)致腰交感神經(jīng)干炎癥因子表達(dá)升高可能與盤源性內(nèi)臟痛的發(fā)生有關(guān)。

炎癥因子；交感干；炎性反應(yīng)；髓核；大鼠

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1567）

腰椎間盤突出癥是臨床的常見疾病，目前研究認(rèn)為椎間盤后突出引起腰腿痛的主要原因是髓核外漏導(dǎo)致的脊神經(jīng)根無菌性炎癥［1－3］。腰椎間盤前突出在臨床上并不少見［4］。由于腰交感神經(jīng)干緊鄰腰椎前方分布，因此，腰椎間盤前突出導(dǎo)致的無菌性炎癥在理論上會刺激腰交感神經(jīng)干產(chǎn)生交感神經(jīng)相關(guān)癥狀；雖然交感神經(jīng)的疼痛傳導(dǎo)通路已經(jīng)被證實(shí)［5，6］，但是椎間盤前突與腰交感神經(jīng)相關(guān)癥狀之間的關(guān)系在臨床尚未被引起重視。本實(shí)驗(yàn)擬采用改良的X線引導(dǎo)下大鼠椎間盤退變模型，通過腰交感神經(jīng)干周圍注射大鼠退變髓核懸液，采用腰交感干組織學(xué)觀察及ELISA法進(jìn)行細(xì)胞因子檢測觀察大鼠退變髓核懸液對交感神經(jīng)的致炎作用，以期揭示椎間盤前突導(dǎo)致交感神經(jīng)炎性病變的產(chǎn)生，為臨床上“椎間盤源性內(nèi)臟痛”的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

ELISA試劑盒（IL－1β，IL－6，及TNF－α）購于美國R＆D公司。造影劑（omnipaque－180dye）購于通用電氣藥業(yè)（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組

實(shí)驗(yàn)動物為雄性SD大鼠，8－10周，體重250－300g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)環(huán)境3天后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)動物單籠飼養(yǎng)，72只大鼠隨機(jī)分為空白對照組（n＝24）、假手術(shù)組（n＝24）和髓核注射組（n＝24）。

1.3 動物模型制作

假手術(shù)組及髓核注射組動物建立大鼠退變髓核模型。大鼠退變髓核模型的建立參考Zhang等報(bào)道的方法［7］，并改進(jìn)為X線引導(dǎo)下穿刺，提高模型成功率及穿刺準(zhǔn)確程度，減少損傷。具體方法為：在X線引導(dǎo)下，將21號穿刺針平行于尾椎終板，穿刺至Co4／5到Co8／9椎間盤中心。數(shù)秒之后，穿刺針拔出，局部壓迫止血。

大鼠退變髓核模型建立2周之后，髓核注射組大鼠苯巴比妥鈉麻醉后斷尾，3－0絲線縫合斷尾處。取尾椎Co4／5到Co8／9椎間盤髓核，見髓核呈膠凍樣，將5個髓核混勻于0.5ml生理鹽水。斷尾縫合之后的大鼠至于X線下，取俯臥位，采用21號穿刺針（3.8cm長）在X線引導(dǎo)下穿刺與L2／3椎體右前外側(cè)，正、側(cè)位透視確定穿刺針位置，穿刺針穿刺到位后，緩慢注射0.5ml造影劑（omnipaque－180 dye），顯示造影劑沿椎體前外側(cè)上下擴(kuò)散呈線性，證實(shí)穿刺到位。穿刺位置確定后10min，緩慢注射之前準(zhǔn)備的0.5ml髓核混懸液于腰交感干周圍。注射完畢后，緩慢退針，穿刺點(diǎn)局部壓迫止血。假手術(shù)組行斷尾術(shù)，腰交感干周圍同樣方法注射0.5ml生理鹽水。空白對照組不行任何處理。

1.4 腰交感干組織學(xué)觀察

腰交感干切片行HE（Hematoxylin and eosin）染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化。腰交感干注射后14天，每組大鼠隨機(jī)取6只，苯巴比妥鈉麻醉后行右側(cè)L（Lumber）1－5交感干取出術(shù)。取出腰交感干標(biāo)本先用10%甲醛液固定1天，再在0.003MEDTA，1.35NHCl溶液中脫鈣24小時，石蠟固定，冠狀切片（5μm），HE染色，鏡下觀察腰交感干組織學(xué)變化。

1.5 ELISA檢測腰交感干細(xì)胞因子IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量

腰交感干注射后14天，采用ELISA檢測方法定量分析大鼠右側(cè)L1－5腰交感干IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量。因?yàn)榇笫髥蝹€腰交感干樣本太小，定量分析數(shù)值太小很難測定，因此我們將每組中剩余18只大鼠隨機(jī)每三只腰交感干合為一組，因此合并為6個檢驗(yàn)樣本。樣本稱重勻漿后，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作順序進(jìn)行蛋白測定，蛋白濃度單位pg／ml。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ELISA檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x—±s）表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腰交感干組織學(xué)觀察

大鼠腰交感干注射后14天，髓核注射組大鼠腰交感干切片HE染色可見明顯的神經(jīng)髓鞘內(nèi)血管腫脹充血、炎性細(xì)胞浸潤，提示腰交感干炎癥反應(yīng)的發(fā)生；空白對照組和假手術(shù)組腰交感干切片HE染色未見有明顯的炎癥反應(yīng)（圖1）。

圖1 大鼠右側(cè)L1－5腰交感干組織學(xué)觀察鏡下所見。石蠟切片空白對照組（A），假手術(shù)組（B）和髓核注射組（C）。髓核注射組可見明顯的交感干炎癥反應(yīng)發(fā)生。直箭頭：炎性細(xì)胞，燕尾箭頭：血管腫脹和充血。HE×400

2.2 ELISA方法檢測腰交感干IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量

腰交感注射后14天收集大鼠右側(cè)L1－5腰交感干采用ELISA法定量分析IL－1β，IL－6，及TNF－α蛋白含量。髓核注射組IL－1β（20.1±4.40pg／ml），IL－6（26.5±8.9pg／ml）及TNF－α（60.77±6.37 pg／ml）蛋白含量明顯比空白對照組IL－1β（8.02± 1.31pg／ml），IL－6（10.30±1.43pg／ml），TNF－α（24.38±4.81pg／ml）及假手術(shù)組IL－1β（7.52± 2.11pg／ml），IL－6（11.58±2.56pg／ml），TNF－α（26.12±6.81pg／ml）顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；提示交感神經(jīng)干炎癥的發(fā)生。假手術(shù)組與空白對照組相比，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P＞0.05，圖2）。

圖2 ELISA檢測各組大鼠右側(cè)L1－5腰交感干細(xì)胞因子IL－1β，IL－6，及TNF－α表達(dá)。＊示與空白對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），＃示與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

雖然腰椎間盤前突出已經(jīng)被認(rèn)為是椎間盤突出的類型之一，但是，椎間盤前突導(dǎo)致的癥狀常被臨床忽視。Wong－Chung等［8］報(bào)道一例因椎間盤前突而導(dǎo)致腹痛的患者，作者推測椎間盤前突導(dǎo)致的交感神經(jīng)炎癥反應(yīng)是該患者腹痛的主要原因。我們在前期［9］進(jìn)行了一項(xiàng)腰椎間盤前突導(dǎo)致內(nèi)臟痛的臨床隊(duì)列研究，應(yīng)用單次交感神經(jīng)阻滯技術(shù)評價(jià)患者的內(nèi)臟痛來源于椎間盤前突出導(dǎo)致的交感神經(jīng)炎癥，對于單次交感神經(jīng)阻滯有效的患者，給予CT引導(dǎo)下腰交感干置管，連續(xù)抗炎治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)連續(xù)抗炎治療對該類患者都取得明顯效果，推測腰椎間盤前突、髓核外漏導(dǎo)致的交感神經(jīng)炎癥是盤源性內(nèi)臟痛的主要原因。

炎性細(xì)胞因子在機(jī)體炎癥反應(yīng)中的作用已經(jīng)被廣泛研究，而且，炎性細(xì)胞因子的表達(dá)已經(jīng)開始作為椎間盤后突出導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的標(biāo)記性物質(zhì)。Andrade等［10］報(bào)道椎間盤突出患者間盤可分泌IL－1β和IL－6；de Souzaet等［11］報(bào)道大鼠椎間盤變性可分泌高濃度的IL－1和TNF－α。Zhang等［7］報(bào)道在椎間盤突出患者可在背根結(jié)發(fā)現(xiàn)有大量TNF－α表達(dá)陽性神經(jīng)元。但是，細(xì)胞因子可以從退變椎間盤分泌，同時也可以從椎間盤退變導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的炎性細(xì)胞分泌。Rand等［12］進(jìn)一步研究報(bào)道體外培養(yǎng)椎間盤退變導(dǎo)致局部浸潤的炎性細(xì)胞可分泌比正常細(xì)胞高75倍的IL－6，150倍的IL－10，但是IL－1和TNF－α分泌無增加，IL－1和TNF－α可能是在退變椎間盤細(xì)胞分泌的。因此，從上述研究來看，IL－1β，IL－6和TNF－α分泌可能來自于不同的細(xì)胞，包括椎間盤退變誘導(dǎo)的局部浸潤炎性細(xì)胞和退變椎間盤自身細(xì)胞，因此，我們選用IL－1β，IL－6和TNF－α這三個細(xì)胞因子來檢測，以證實(shí)局部炎癥的產(chǎn)生。

我們應(yīng)用先前研究椎間盤后突出導(dǎo)致脊神經(jīng)根炎癥的方法，將自體退變髓核注射于交感神經(jīng)干周圍，交感神經(jīng)干組織學(xué)切片發(fā)現(xiàn)有明顯的神經(jīng)內(nèi)血管擴(kuò)張，大量炎性細(xì)胞浸潤；并進(jìn)一步應(yīng)用ELISA法檢測了交感神經(jīng)干細(xì)胞因子含量，發(fā)現(xiàn)IL－1β，IL－6和TNF－α都顯著增高；提示自體退變髓核引起明顯的交感神經(jīng)干炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：髓核前漏出會導(dǎo)致相鄰交感神經(jīng)的無菌性炎癥的產(chǎn)生。該結(jié)論提示椎間盤源性內(nèi)臟痛可能是由于腰椎前方腰交感神經(jīng)干自體退變髓核導(dǎo)致的無菌性炎癥累及導(dǎo)致的，同時為腰交感神經(jīng)抗炎治療盤源性內(nèi)臟痛提供了理論依據(jù)。

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The effects of degenerative autologous nucleus pulposus injected to lumbar sympathetic trunk on expression of inflammatory cytokine in rats

BIAN Jing－jing1，TANG Yuan－zhang2，WU Bai－shan2，et al.（1.Department of anesthesiology，Yuquan Hospital of Tsinghua University，Beijing100049，China；2.Department of Pain Management，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing100053，China）

ObjectiveThe aim of the study was to observe the inflammatory response of sympathetic trunk by autologous degenerative nucleus pulposus（NP）injection under fluoroscopy.MethodsA total 72rats was used，which divided in 3group：na?ve group，sham group and NP－treated group.24rats in NP－treated group，autologous NP suspension was injected to right sympathetic trunk.14days after injection，right lumbar sympathetic trunk was harvested for histological assessment and ELISA quantitative determination of IL－1β，IL－6，and TNF－αprotein.ResultsIn the NP treated group，endoneural hyperemia and intensive infiltration of inflammatory cells can be seen in section of sympathetic trunk by Hematoxylin and Eosin（HE）stained，Meantime，elevated concentration of IL－1β（20.1±4.40pg／ml），IL－6（26.5 ±8.9pg／ml）and TNF－α（60.77±6.37pg／ml）by ELISA of sympathetic trunk in NP－treated group compared to na?veIL－1β（8.02±1.31pg／ml），IL－6（10.30±1.43pg／ml），TNF－α（24.38±4.81pg／ml）and controlIL－1β（7.52± 2.11pg／ml），IL－6（11.58±2.56pg／ml），TNF－α（26.12±6.81pg／ml）group（P＜0.05）.ConclusionElevated expression of inflammatory cytokine，which caused by degenerative autologous nucleus pulposus injected to lumbar sympathetic trunk，may be related to discogenic visceral pain.

inflammatory cytokine；sympathetic trunk；inflammation；nucleus pulposus；rat

R338.7

A

2014－01－20）

＊通訊作者