王亮 林建立

TPM1在鼻咽癌中的表達及其臨床意義

王亮 林建立

目的觀察TPM1基因的表達與鼻咽癌(NPC)的關系。方法采用實時定量rt-PCR技術檢測TPM1基因在NPC細胞株(CNE1、CNE2、58F)和鼻咽上皮細胞株(NP69)中的表達；采用組織芯片技術通過免疫組化檢測TPM1在124例惡性鼻咽癌腫瘤、31例對應的癌旁正常組織和12例正常鼻咽黏膜組織的表達。結果TPM1 mRNA在NP69中表達水平較高, 而在NPC細胞株中表達水平顯著下降。正常鼻咽黏膜及癌旁組織中TPM1蛋白染色陽性表達率約為65.1% (28/43)；而在鼻咽癌組織中陽性表達率約為34.7%(43/124)；TPM1蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負相關(P＜0.05), 與頸淋巴結轉移(N)無關(P＞0.05)。結論TPM1基因表達的抑制可能參與鼻咽癌的發(fā)生。

TPM1；鼻咽癌；基因表達

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方較高發(fā)的惡性腫瘤, 嚴重危害公眾健康, 其病因目前尚不明確?；颊叱踉\時常伴有頸部淋巴結轉移, 因此急需尋找能用于鼻咽癌早期診斷以及預后的生物標志物, 為早期診斷和治療提供線索。

原肌球蛋白(tropomyosin, TM)是一種在肌肉收縮過程中扮演重要角色的調(diào)節(jié)蛋白, 在細胞運動和促使細胞凋亡等方面具有重要作用［1］。TM廣泛分布于各種真核細胞中, 在肌肉(如骨骼肌、心肌和平滑肌)和非肌肉細胞中均有表達［2］。TM家族包括TPM1、TPM2、TPM3和TPM4四個成員［3,4］,有研究表明, TPM1 在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用, 乳腺癌、膀胱癌和神經(jīng)纖維瘤等腫瘤中［5-7］, TPM1 表達明顯低于正常組織, 而 TPM1在鼻咽癌中的表達尚未見報道。

本研究通過對鼻咽癌細胞株和鼻咽上皮細胞株的TPM1基因mRNA表達水平的檢測并利用組織芯片配合免疫組化觀察TPM1蛋白表達在鼻咽癌組織和正常及癌旁組織中的差異, 探討TPM1的表達與鼻咽癌之間的關系及其臨床意義?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen公司； 反轉錄酶購自 TaKaRa 公司；熒光定量PCR MIX(SYBR染料法)購自ABI公司。胎牛血清及 RPMI1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；組織芯片NPC961和NPC962購自西安艾麗娜生物科技有限公司；兔抗人TPM1抗體(ab55915)購于 Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購于碧云天生物公司。

細胞培養(yǎng)：3株鼻咽癌細胞CNE1、CNE2、58F和1株鼻咽上皮細胞NP69由中山大學腫瘤中心康鐵邦教授惠贈；用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基在 5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2方法 rt-PCR檢測TPM1mRNA的表達, Trizol提取總RNA,采用反轉錄酶(TaKaRa)按說明書合成cDNA。PCR擴增引物由華大生物技術有限公司合成：TPM1基因引物上游：5'-CCGTAAGCTGGTCATCATT-3',下游：5'-TCTCTTCCTCATATCTGTCTTC-3',產(chǎn)物長度176bp；actin引物上游：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游：5'-GCTGTCACCTTCACCTTTCC-3',產(chǎn)物長度268 bp。采用20 μl的反應體系,每個樣本重復3次,求平均Ct值作為實驗結果。反應過程具體為：95℃預變性3 min；95℃變性13 s, 59℃退火和延伸45s,擴增40個循環(huán)。計算ΔCT=Ct(TPM1)-Ct(actin)；再根據(jù)ΔΔCT=ΔCT(腫瘤細胞株)-ΔCT(NP69),進一步計算TPM1在腫瘤細胞株與NP69之間表達倍數(shù)的差異。

1.3組織芯片及免疫組化分析 組織芯片NPC961和NPC962包含124例原發(fā)性鼻咽癌腫瘤、31例對應的癌旁正常組織和12例正常鼻咽黏膜組織。組織芯片經(jīng)二甲苯脫石蠟, 乙醇再水化, PBS清洗, 置于0.01 M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)在微波爐中加熱使抗原復活, 3% H2O2中室溫浸泡10 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性, 抗-TPM1于4℃孵育過夜, 滴加二抗工作液, DAB顯色劑顯色, 蘇木精復染后, 中性樹膠封片,于普通顯微鏡下觀察。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料相關性分析及率的比較用Pearson’s χ2檢驗或Fisher’s精確檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TPM1在鼻咽癌細胞株中的表達 為了比較TPM1在鼻咽癌細胞和正常細胞間的表達差異, 作者分別利用實時定量rt-PCR比較了高分化型鼻咽癌細胞株CNE1、低分化型鼻咽癌細胞株CNE2、高轉移型鼻咽癌細胞株58F和鼻咽上皮細胞株NP69中TPM1的mRNA表達水平。結果表明, 在正常鼻咽上皮細胞株NP69中TPM1的mRNA表達水平較高, 而在3種鼻咽癌細胞株中表達水平均顯著下降, 見圖1。

2.2TPM1蛋白在組織中的表達及與臨床病理因素的關系鼻咽癌組織中TPM1蛋白染色主要位于細胞質(zhì)內(nèi), 呈棕黃色, 見圖2。在43例正常鼻咽黏膜及癌旁組織中有28例為明顯TPM1蛋白染色, 陽性表達率約為65.1%；而在124例鼻咽癌組織中則有43例為TPM1蛋白染色陽性, 陽性表達率約為34.7%；正常及癌旁組織中的TPM1蛋白陽性率明顯高于鼻咽癌組織(P＜0.01)見表1。TPM1蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負相關(P＜0.05), 與頸淋巴結轉移(N)無關(P＞0.05), 見表2。

圖1 TPM1 mRNA在NP69、CNE1、CNE2、58F細胞株中的相對表達水平

圖2 TPM1在組織中的表達

表1鼻咽癌組織及正常組織中TPM1蛋白免疫組化檢測結果

表2TPM1表達與臨床病理特征的關系

3 討論

原肌球蛋白是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白, 廣泛分布于各種真核細胞中。研究表明, 在非肌肉細胞中, TPM1發(fā)揮著細胞轉化抑制劑的作用, 一旦 TPM1 受損或缺失, 將導致細胞惡性轉化, 但具體過程仍不清楚。作者通過實時定量rt-PCR檢測3種鼻咽癌細胞株(CNE1、CNE2、58F)和NP69中TPM1基因mRNA的表達, 發(fā)現(xiàn)相對于NP69細胞株, CNE1、CNE2和58F細胞株中TPM1基因mRNA表達顯著下降,提示TPM1基因表達抑制可能與鼻咽癌發(fā)生有關。原位雜交和免疫熒光實驗證實, 在正常乳腺組織中可檢測到TPM1 mRNA和蛋白表達, 而在乳腺癌中TPM1表達受抑制［5］?，F(xiàn)已證明TPM1基因啟動子甲基化是其在乳腺癌中表達受抑制的主要機制, 而上調(diào)TPM1基因的表達則表現(xiàn)出抑制細胞增值的效果［8］。這些結果都表明TPM1表達抑制可能與腫瘤發(fā)生有關。

作者的研究發(fā)現(xiàn), TPM1在34.7%(43/124)的鼻咽癌組織中有表達。在正常的鼻咽上皮組織及癌旁組織中, TPM1蛋白為65.1%(28/43)的陽性表達率, 表明相對于正常組織而言, TPM1蛋白在鼻咽癌組織中表達受到抑制。這種差異表達提示TPM1蛋白在鼻咽癌的發(fā)生中可能具有一定的作用。進一步與臨床病理因素的相關分析發(fā)現(xiàn)TPM1蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負相關(P＜0.05)。由此可以推斷TPM1的表達水平可以反映腫瘤細胞的增值程度與分化狀態(tài)。

綜上所述, 本研究通過比較鼻咽癌細胞株和鼻咽上皮細胞株中TPM1基因的mRNA表達水平的差異, 發(fā)現(xiàn)該基因的表達在鼻咽癌細胞株中存在較為顯著的表達抑制。組織芯片免疫組化結果發(fā)現(xiàn)TPM1蛋白在腫瘤組織中表達率顯著低于在正常組織和癌旁組織中的表達率且TPM1蛋白表達水平與腫瘤的侵犯范圍(T)呈負相關。以上結果表明TPM1基因表達的抑制可能參與鼻咽癌的發(fā)生。

［1］ Lin JJ, Warren KS, Wamboldt DD, et al.Tropomyosin isoforms in nonmuscle cells.Int Rev Cytol, 1997(170):1-38.

［2］ Lees-Miller JP, Helfman DM.The molecular basis for tropomyosin isoform diversity.Bioessays , 1991(13):429-437.

［3］ Lin JJ, Eppinga RD, Warren KS, et al.Human tropomyosin isoforms in the regulation of cytoskeleton functions.Adv Exp Med Biol, 2008, 6(44):201-222.

［4］ Vrhovski B, Theze N, Thiebaud P.Structure and evolution of tropomyosin genes.Adv Exp Med Biol, 2008(644): 6-26.

［5］ Raval GN, Bharadwaj S, Levine EA, et al.Loss of expression oftropomyosin-1, a novel class II tumor suppressor that induces anoikis, in primary breast tumors.Oncogene, 2003(22):6194-6203.

［6］ Pawlak G, McGarvey TW, Nguyen TB, et al.Alterations in tropomyosin isoform expression in human transitional cell carcinoma of the urinary bladder.Int J Cancer, 2004(110):368-373.

［7］ Yager ML, Hughes JA, Lovicu FJ, et al.Functional analysis of the actin-binding protein, tropomyosin 1, in neuroblastoma.Br J Cancer, 2003(89):860-863.

［8］ Bharadwaj S, Prasad GL.Tropomyosin-1, a novel suppressor of cellular transformation is downregulated by promoter methylation in cancer cells.Cancer Lett, 2002(183):205-213.

TPM1 expression and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

WANG Liang, LIN Jian-li.
School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China

ObjectiveTo investigate the relation between TPM1 gene expression and nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsTPM1 expression was examined in three NPC cell lines (CNE1, CNE2 and 58F) and one nasopharyngeal epithelial cell line (NP69) by real time rt-PCR analysis and in tissue array with 124 specimens of malignant NPC, 31 NPC specimens adjacent areas and 12 normal mucosa tissues by immunohistochemistry staining.ResultsCompared to NP69, TPM1 mRNA expression level is significantly lower in three NPC cell lines.The positive rates of TPM1 protein were 65.1% (28/43) in NPC specimens adjacent areas and normal mucosa tissues and were 34.7% (43/124) in malignant NPC tissues.The expression of TPM1 protein in NPC was negatively related to that in degree of infiltration (T) (P＜0.05) but not related to that in lymph node metastasis (N) (P＞0.05).ConclusionDown-regulated of TPM1 expression may be associated with the tumorigenesis of NPC.

TPM1; Nasopharyngeal carcinoma; Gene expression

2014-06-18］

518060 深圳大學醫(yī)學部

王亮