白龍律,尹振浩,尹成日*

(1.延邊州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林 延吉 133000； 2.延邊大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)系，吉林 延吉 133002)

延邊蘋果梨是我國優(yōu)良梨品種之一，其果肉細(xì)脆、汁多，營養(yǎng)豐富[1].研究顯示，蘋果梨果肉中含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、硫胺素、尼克酸、抗壞血酸等營養(yǎng)成分[2]，并且具有燥濕健脾、軟化血管、止嘔止瀉、消痰止咳等保鍵功能[3].延邊蘋果梨資源豐富，但由于目前加工轉(zhuǎn)化能力較低，蘋果梨資源沒能得以充分利用.研究[4]表明，果醋中含有豐富的有機(jī)酸、氨基酸、維生素及礦物質(zhì)，具有食療保健、美白護(hù)膚、抗病、抗衰老、抗疲勞等功能.目前，果醋的制備主要采用將果汁經(jīng)過酒精發(fā)酵后，再進(jìn)行乙酸發(fā)酵的微生物發(fā)酵法[5].醋酸菌是水果醋生產(chǎn)過程中最重要的因素.在20世紀(jì)以前，醋酸菌屬分為兩個(gè)屬：一是可以將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸的Gluconobacter[6]；二是可以將醋酸進(jìn)一步氧化成二氧化碳和水的Acetobacter[7].進(jìn)入20世紀(jì)后，通過生物基因研究和分子生物學(xué)分類法，醋酸菌被分為Ameyamaea,Acetobacter,Gluconobacter,Acidomonas,Gluconacetobacter,Asaia,Kozakia,Swaminathania,Saccharibacter,Neoasaia,Granulibacter,Tanticharoenia等12個(gè)屬[8-9]，其中葡萄醋桿菌屬(Gluconacetobacter)是醋酸菌科的一個(gè)重要菌屬，一些葡萄醋桿菌如Ga.europaeus和Ga.entanii在工業(yè)醋特別是高酸度醋的發(fā)酵中具有重要作用[10].本文從5種水果樣品中分離得到葡萄醋桿菌，并探討了乙醇濃度、菌株接種量、發(fā)酵液有效體積對醋酸發(fā)酵的影響.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蘋果梨由吉林省延吉市華龍集團(tuán)提供；乙醇為天津協(xié)和醫(yī)學(xué)科技公司生產(chǎn)；溴甲酚紫為天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；氫氧化鈉為大連華中試劑廠生產(chǎn),其他化學(xué)試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)儀器有HZQ-C型全溫振蕩器(中國哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，LZDX-30型蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱和BSC-1300 ⅡA/B3型生物安全柜(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1微生物的分離 取西瓜、紅葡萄、柿子、蘋果梨、草莓等5種樣品，用粉碎機(jī)將各種水果樣品粉碎制漿后，121 ℃滅菌20 min，然后在陰涼通風(fēng)處放置7 d.待樣品的pH值下降后，取1 g的樣品溶于9 mL無菌蒸餾水中，將樣品從10-1稀釋到10-6.選取10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液，分別取0.1 mL用無菌三角棒將溶液均勻涂布在R2A、MRS、Nu、YM等平板培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)7 d.挑取單一菌落涂布于新鮮的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，在4 ℃保藏備用.

1.2.2醋酸菌的篩選 取純化培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)移到Y(jié)EGA培養(yǎng)基中.由于每100 g YEGA培養(yǎng)基中含有30 mg的溴甲酚紫(指示劑的變色范圍為pH 6.8紫色—pH 5.2黃色)，醋酸菌將培養(yǎng)基中的乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸時(shí)，醋酸菌周圍的pH下降，導(dǎo)致菌落周圍會生成黃色條帶.因此，分離菌落周圍出現(xiàn)黃色條帶的菌株，用于下一步實(shí)驗(yàn).

1.2.3高效醋酸菌的篩選 用接種環(huán)挑取2環(huán)醋酸菌菌體，接入100 mL液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后得到菌懸液，在4 ℃條件下冷藏備用.為了篩選出高產(chǎn)醋酸的高效菌株，將分離得到的醋酸菌在不同乙醇濃度、不同接種量、不同發(fā)酵液有效體積等3個(gè)條件下進(jìn)行正交試驗(yàn).通過正交試驗(yàn)篩選出的高效菌株，用于下一步蘋果梨汁的發(fā)酵實(shí)驗(yàn).具體條件參見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.4蘋果梨醋的發(fā)酵 挑選發(fā)育成熟、果皮紅潤的蘋果梨，去皮、去核后放入榨汁機(jī)制備蘋果梨汁.將得到的蘋果梨汁利用孔徑為4 μm的濾膜過濾后，在紫外燈下照射15 min，然后在121 ℃條件下滅菌15 min.經(jīng)滅菌后的粗果汁再利用孔徑為0.6 μm濾膜過濾，得到蘋果梨汁.

首先，利用實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌對蘋果梨汁進(jìn)行酒精發(fā)酵.當(dāng)蘋果梨酒的酒精度達(dá)到正交試驗(yàn)的最佳酒精濃度時(shí)，取25 mL的菌懸液與100 mL蘋果梨酒混合后放入250 mL錐形瓶中，在80 ℃滅菌15 min.然后，在滅菌的蘋果梨酒中接種預(yù)先培養(yǎng)好的醋酸菌菌懸液，在30 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中發(fā)酵得到蘋果梨醋.最后，利用0.1 mol/L NaOH測定總酸的濃度.

1.2.5形態(tài)學(xué)鑒定 采用三點(diǎn)接種法，將菌株分別接種于YEGA培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)3 d后，肉眼觀察菌落特征，并在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征.

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物的分離篩選

在平板培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫為指示劑，從上述5種水果樣品中分離得到20種醋酸菌，其編號為AAB1-AAB20.

2.2 高效醋酸菌的篩選

從分離得到的20種醋酸菌中，篩選出一種高產(chǎn)醋酸菌.在菌株的初篩工作中，利用正交分析法在不同的乙醇濃度、菌株接種量、發(fā)酵液有效體積等條件下測定每個(gè)菌株的產(chǎn)酸能力，并篩選出高效醋酸菌AAB13.

圖1為接種量為20%、發(fā)酵液有效體積為50%時(shí)不同濃度的乙醇對產(chǎn)酸量的影響.結(jié)果表明，乙醇濃度越高，產(chǎn)酸量達(dá)到最高值所需的時(shí)間越短.從圖1中可以看出，當(dāng)乙醇濃度為8%時(shí)發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量達(dá)到最高值.因此，在蘋果梨醋的發(fā)酵過程中將發(fā)酵液的乙醇濃度定為8%.

圖1 初始乙醇濃度對醋酸發(fā)酵的影響

圖2為乙醇體積濃度為8%、發(fā)酵液有效體積為50%時(shí)不同接種量對產(chǎn)酸量的影響.結(jié)果表明，接種量對發(fā)酵速度和產(chǎn)酸量的影響較大.當(dāng)接種量為10%時(shí)，最高產(chǎn)酸量不及接種量20%和30%的產(chǎn)量；當(dāng)接種量為30%時(shí)，雖然發(fā)酵周期短，但最終產(chǎn)酸量比接種量20%時(shí)低，這可能是由于過多的接種量使微生物大量繁殖，造成營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧短缺，不利于發(fā)酵后期的代謝作用，從而影響了產(chǎn)物的生成量.因此，在蘋果梨醋的發(fā)酵過程中醋酸菌的接種量定為20%.

圖2 菌株接種量對醋酸發(fā)酵的影響

發(fā)酵液的有效體積直接影響發(fā)酵過程中溶解氧的濃度.溶解氧是微生物發(fā)酵過程中一個(gè)至關(guān)重要的參數(shù)，好氧微生物在進(jìn)行深層培養(yǎng)時(shí)，需要適量的溶解氧以維持呼吸代謝和代謝產(chǎn)物的合成，氧的不足會造成代謝異常，降低產(chǎn)量，但是過多的溶解氧會給微生物的生長帶來不利影響.

圖3為乙醇體積濃度為8%、接種量為20%時(shí)發(fā)酵液有效體積對產(chǎn)酸量的影響.結(jié)果表明，發(fā)酵液有效體積為50%時(shí)產(chǎn)酸效果最佳.利用正交分析法在不同乙醇濃度、菌株接種量、發(fā)酵液有效體積等條件下，測定每個(gè)菌株的產(chǎn)酸能力.在20種醋酸菌中，AAB13的產(chǎn)酸能力最為突出，并且在乙醇體積濃度為8%、菌株接種量為20%、發(fā)酵液有效體積為50%時(shí)其產(chǎn)酸量達(dá)到最高值.

圖3 發(fā)酵液有效體積對醋酸發(fā)酵的影響

2.3 蘋果梨醋的制備

乙醇的發(fā)酵利用本實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌進(jìn)行.酒精發(fā)酵結(jié)束后，以乙醇體積濃度為8%的蘋果梨酒作為蘋果梨醋發(fā)酵原料，利用高效菌株AAB13在30 ℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行發(fā)酵.

經(jīng)過正交試驗(yàn)表明，在分離得到的20種醋酸菌中，菌株AAB13在乙醇體積濃度為8%、接種量為20%、容器中發(fā)酵液體積為50%的條件下其產(chǎn)酸量最高，酸度達(dá)到5.3%.對發(fā)酵產(chǎn)物的主要理化指標(biāo)進(jìn)行測定，其結(jié)果如表2所示.

表2 理化指標(biāo)測定結(jié)果

2.4 AAB13菌株的鑒定

AAB13菌株的形態(tài)學(xué)特征：AAB13菌侏在YEGA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，菌落平均直徑為22 mm，菌落中心為淺黃色，邊緣為白色，細(xì)胞呈桿狀(圖4).

圖4 菌株AAB13的形態(tài)特征

菌株AAB13的16S rDNA測序結(jié)果如下：

CGCAGTGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTACGGTTACCTTGTTACGACTTCACCCAGTCGCTGACCCGACCGTGGTCGGCTGCGCCCCTTGCGGGTTCGCTCACCGGCTTAAGGTCAAACCAACTCCCATGGTGTGATCACCCAGTCGCTGACCCGACCGTGGTCGGCTGCGCCCCTTGCGGGTTCGCTCACCGGCTTAAGGTCAAACCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTAGAGATCAGCACGATGTCACCATCTAGCTTCCCACTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGACATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTGTCACCGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCACCCAAACATGCTGGCAACTAAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTAGAGGTCCCTTGCGGGAAATATCCATCTCTGAATACAGCCTCTACATTCAAGCCCTGGTAAGGTTCTGCGCGCTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCG.

利用菌株AAB13的16S rDNA序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，從圖中可以看出，菌株AAB13歸屬于葡糖醋桿菌屬.

圖5 菌株AAB13的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從西瓜、葡萄、柿子、蘋果梨、草莓等5種水果中分離出20種醋酸菌株AAB1-AAB20，其中菌株AAB13在起始乙醇體積濃度為8%、菌株加入量為20%、發(fā)酵液有效體積為50%的條件下，產(chǎn)酸量最高，酸度達(dá)到5.3%.通過分子生物學(xué)鑒定得知，菌株AAB13歸屬于葡糖醋桿菌屬.

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