江西地方藥材野山楂葉質量標準研究

★ 鄧茂芝 胡榮 彭雪芬

(1.宜春市食品藥品檢驗所 江西 宜春 336000；2.宜春市第六人民醫(yī)院 江西 宜春 336000)

江西地方習用藥材山楂葉，收載于1996年版《江西省中藥材標準》，為薔薇科野山楂的干燥葉，夏秋二季采收。具有清熱解暑、降血壓的功效，主要用于感受暑邪、高血壓等肝熱陽亢之癥。原標準僅有性狀、顯微鑒別兩項，難以適應復雜的市場要求，不能有效控制其質量。因此為達到江西省新版中藥材標準的要求，對藥材山楂葉的質量標準進行提高研究。

1 儀器、試藥與藥材來源

Agilent1200高效液相色譜儀；BP211D電子天平；KH-250DB型數控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110742-200517)；甲醇、磷酸為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。薄層板為自制板。

野山楂葉供試品來源20130801(明月山)、20130802(金瑞)、20130803(飛劍潭)、20130804(寨下)，均為轄區(qū)內深山采集，經鑒定為真品。

2 藥材性狀

葉片多完整。稍卷皺縮，展平后葉片呈寬倒卵形至卵狀矩圓形，長2～6cm，寬1～4.5cm，頂端常有3～7淺裂片，基部楔形，下延于葉柄，邊緣有刻缺或不規(guī)則鋸齒，上表面黃綠色，無毛；下表面淺綠色或淡黃綠色，無毛或僅于葉脈有短柔毛，葉脈略突出于下表面，側脈伸至裂片先端。質脆，易碎。氣微，味微澀。

3 藥材鑒別

3.1 顯微鑒別 本品粉末淺綠色。上表皮細胞多角形，垂周壁略增厚，較平直，表面有角質狀線紋，無氣孔和非腺毛；下表皮細胞垂周壁波狀彎曲，有氣孔和非腺毛；氣孔不定式，副衛(wèi)細胞3～7個；單細胞非腺毛長150～620μm，直徑10～28μm，壁厚4～13μm。

3.2 薄層鑒別[1-4]取本品粉末1g，加乙醚30mL超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇-三氯甲烷(3∶2)混合溶液2mL使溶解，作為供試品溶液。另取取熊果酸對照品適量加乙酸乙酯制成每1mL含熊果酸1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ)試驗，吸取上述對照品各5μL，分別點于同-0.3%羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(25∶15∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點斑點，見圖1。

1.熊果酸對照品；2～5.供試品溶液

4 含量測定

4.1 色譜條件[5-8]色譜柱:Thermo BDS HYPERSIL C18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-0.05%磷酸溶液(87∶13);檢測波長:210nm;柱溫:25℃;流速為1.0 mL/min,進樣量10μL。在此條件下熊果酸峰與雜質峰能得到較好分離,見圖2。

A.對照品色譜圖；B.供試品色譜圖；1.熊果酸

4.2 溶液的制備

4.2.1 對照品溶液制備 精密稱取熊果酸對照品9.92mg，置50mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液(0.1984mg/mL)。

4.2.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過二號篩)約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流30min，取出，放冷，用甲醇補足重量，搖勻，濾過，即得。

4.3 線性關系考察 精密吸取熊果酸對照品儲備液(0.1984 mg/mL)1,2,3,5,6,7,10 mL，分別置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定峰面積。以進樣量為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線，回歸方程為：Y=5251.8X-9.8937(r=0.9991)。結果在0.01984～0.1984mg范圍內呈良好的線性關系。

4.4 精密度試驗 .取供試品溶液,按上述色譜條件重復進樣6次,測定峰面積,結果RSD為0.81%(n=6),表明精密度良好。

4.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,按上述色譜條件,間隔0,2,4,6,8,12h，測定峰面積,結果RSD為1.71%(n=6),顯示供試品溶液至少在12h內穩(wěn)定。

4.6 重復性試驗 精密稱取同一批號(20130801)樣品6份,按4.2.2項下方法操作,測定峰面積并計算熊果酸含量,平均含量為10.38mg/g,RSD=1.20%(n=6)。

4.7 回收率試驗 精密稱取已知含量樣品9份,精密加入熊果酸對照品適量,按4.2.2項下方法操作,測得峰面積并計算含量。回收率為98.71%,RSD分別為0.64%。見表1。

表1 回收率試驗結果(n=9)

4.8 樣品測定 取本品4批,按4.2.2項下方法操作,并按上述色譜條件,精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定含量,結果見表2。

表2 供試品含量測定結果(/mg·g-1，n=4)

5 討論

山楂葉收載于《江西省中藥材標準》1996年版。在編纂新版江西省中藥材標準實地考察中發(fā)現，我省地方藥材山楂葉除了有野山楂外，還發(fā)現一種與其特征相似的品種-湖北山楂。野山楂葉原植物特點是葉柄有翅，葉緣鋸齒呈銳角，3～7對深裂。而湖北山楂葉柄無翅，葉緣鋸齒鈍圓，2～4對淺裂。

熊果酸采用TLC鑒別及HPLC法專屬性強,因此,文中建立了熊果酸TLC定性及HPLC定量的方法,以進一步完善野山楂葉的質量標準。在DAD圖譜上查看熊果酸對照品的光譜掃圖,205nm處有最大吸收,因205nm接近末端吸收,且溶劑甲醇截止吸收波長為205nm,為了減小溶劑的短波吸收干擾,選擇210nm為檢測波長。在此檢測波長下對照品和樣品都能得到較好的光譜圖。

在供試品溶液制備過程中,由于熊果酸為非極性成分,依據其溶解性能,對甲醇、無水乙醇，乙醚等不同的提取溶媒進行優(yōu)選,根據提取效果選擇了甲醇作為提取溶媒?？疾斐?、回流等不同提取方法后,發(fā)現超聲提取法提取效果低于熱回流提取,故選擇加熱回流提取法且熊果酸的提取比較完全,雜質較少。

供試品測定結果表明，因山楂葉生長地域環(huán)境等因素的不同，熊果酸含量差異較大(近4倍)，可能影響用藥的療效。因此，有必要建立有效的質量標準以控制質量。

[1]江西省衛(wèi)生廳．江西省中藥材標準[M].南昌：江西科學技術出版社，1996：18.

[2]鐘方麗，王曉林，張儉.山玫片的薄層鑒別研究[J].吉林化工學院學報，2007，24(4)：6-8.

[3]王維禮,程曉英，付凌燕,等．薄層掃描法測定山楂丸中熊果酸含量[J].中國藥業(yè)，2007，19(16)：18.

[4]萬義,宋曉寧．薄層掃描法測定小兒山楂咀嚼片中熊果酸的含量[J].貴州醫(yī)藥，2005，9(29)：839-840.

[5]盧文勝,危華玲.高效液相色譜法測定山楂葉提取物中熊果酸的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2008，14(6)：15-16.

[6]張妍,李厚偉,張永春,等.山楂中總黃酮幾種提取分離方法的考察及含量測定[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報,2001,35(3):183-184.

[7]梁恕坤，付慶霞，馮尚彩.HPLC法同時測定山楂葉提取物中的7種主要成分[J].齊魯藥事，2009，28(1)：20-22.

[8]王領弟，李艷榮，潘海峰,等．山楂葉的研究近況[J].承德醫(yī)學院學報，2011，28(3)：313-315.