肺癌血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的建立＊

李雪華 劉燕青 谷彥軍 劉 靜

1 武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，天津市 300162； 2 天津市職業(yè)與環(huán)境危害防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

肺癌已成為當(dāng)前世界各國(guó)常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后很差，5年存活率僅為14%［1］。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）為肺癌的研究提供了新的思路和技術(shù)平臺(tái)。雙向凝膠電泳（two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2－DE）是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)［2］。固相pH 梯度（immobilized pH gradient，IPG）干膠條的出現(xiàn)使得2－DE的重復(fù)性大大改善，盡管如此，穩(wěn)定性和重復(fù)性仍然是2－DE技術(shù)的主要問題。本研究利用2－DE技術(shù)分離肺癌血清蛋白質(zhì)，建立穩(wěn)定的肺癌血清蛋白質(zhì)2－DE圖譜，對(duì)2－DE的條件進(jìn)行了各方面的調(diào)整優(yōu)化，為進(jìn)一步的肺癌血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 肺癌血清標(biāo)本取自武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院。IPG干膠條（pH 3～10L、pH 3～10NL、pH 4～7，17cm）、IEF buffer（pH 3～10）、三丁基膦（Tributyl phosphine，TBP）均為Bio－Rad公司產(chǎn)品；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（DTT）、CHAPS、SDS等均為Sigma公司產(chǎn)品。等電聚焦儀（Protean IEF cell）、垂直電泳系統(tǒng)（proteanⅡxi cell）均購(gòu)自Bio－Rad公司，透射掃描儀為 Umax PowerLook 1100。

1.2 方法

1.2.1 血清收集：取研究對(duì)象肘正中靜脈血3ml，4℃放置50min，1 500r／min離心10min，吸取血清，Bradford法測(cè)定血清蛋白濃度，分裝，存于－80℃冰箱備用。

1.2.2 雙向凝膠電泳：2－DE 方法主要參考文獻(xiàn)［3］和儀器操作手冊(cè)進(jìn)行。以pH 4～7、17cm IPG膠條為例。600μg蛋白質(zhì)與上樣緩沖液（7mol／L尿素，2mol／L 硫 脲，4%CHAPS，50mmol／L DTT，2mmol／L TBP，0.2%IEF buffer pH 3～10，痕量溴酚藍(lán)）充分混合，總體積為400μl，上樣，膠條被動(dòng)重水化16h；等電聚焦電泳（IEF）條件為250V1h、500V1h、1 000V1h、5 000V3h、10 000V70 000 Vh；等電聚焦完畢，IPG膠條立即在平衡液 A（6mol／L 尿 素、2%SDS、pH 8.8 的 0.05mol／L Tris－HCL、20%甘油、2%DTT）中平衡15min，再于平衡液B（以2.5%碘乙酰胺替換平衡液A中2%DTT）中平衡15min。之后的垂直板SDS－PAGE電泳條件為每塊膠12mA 30min、每塊膠24mA直至溴酚藍(lán)達(dá)膠底線。

1.2.3 凝膠染色：2－DE所得凝膠參考文獻(xiàn)進(jìn)行硝酸銀染色［4］。

2 結(jié)果與討論

通過以上方法和實(shí)驗(yàn)條件能夠得到較穩(wěn)定的肺癌血清蛋白質(zhì)2－DE圖譜，蛋白質(zhì)點(diǎn)能夠較好分離。實(shí)驗(yàn)的條件的調(diào)整與優(yōu)化主要從以下各方面進(jìn)行。

2.1 IPG膠條的pH范圍的選擇 最初本研究采用pH 3～10L（線性）膠條分析蛋白總體情況，發(fā)現(xiàn)血清蛋白主要集中于pH 4～7段（圖1A），后來筆者應(yīng)用了pH 3～10NL（非線性）（圖1B）、pH 4～7（圖1C）和pH 4.7～5.9的膠條（圖1D），進(jìn)一步提高上樣量、分辨率以及低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)能力。

圖1 IPG膠條pH范圍的選擇

2.2 蛋白質(zhì)的加樣量 對(duì)于某一特定pH范圍的IPG膠條，選擇合適的蛋白質(zhì)加樣量才能使2－DE圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰分辨。加樣量過大，會(huì)使蛋白點(diǎn)融合，分辨率降低，不利于軟件分析和取點(diǎn)鑒定；加樣量過小，則低豐度蛋白不能被檢測(cè)。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)摸索，加樣量600μg比較適合，大部分蛋白點(diǎn)能夠清晰分辨。

2.3 聚焦參數(shù)設(shè)置 對(duì)于不同的樣品、不同的上樣量、不同的pH范圍的膠條、不同的標(biāo)本處理方法或者不同的樣品緩沖液聚焦參數(shù)的設(shè)置是不同的，具體條件要實(shí)驗(yàn)摸索。聚焦不夠，蛋白沒有到達(dá)相應(yīng)的等電點(diǎn)部位，會(huì)出現(xiàn)橫向條紋；但是聚焦過度，蛋白質(zhì)會(huì)在等電點(diǎn)附近發(fā)生沉淀，同樣會(huì)出現(xiàn)橫向條紋；而且二者都可能使所能檢測(cè)的蛋白點(diǎn)數(shù)減少。最初實(shí)驗(yàn)中由于聚焦過度2－DE圖譜中出現(xiàn)一些橫向的細(xì)條紋。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整，最終所設(shè)置的IEF聚焦參數(shù)為：對(duì)于pH4～7的膠條，600μg左右的上樣量，按照前述聚焦步驟，總Vh 70 000左右，能夠?qū)ρ宓鞍踪|(zhì)較好的分離；對(duì)于pH4.7～5.9的膠條，1 400μg左右的上樣量，總Vh 85 000左右。以下為聚焦過度和聚焦適度的2－DE圖譜比較（圖2）。

圖2 IEF聚焦參數(shù)設(shè)置對(duì)2－DE結(jié)果的影響

2.4 血清蛋白質(zhì)緩沖液 2－DE樣品蛋白質(zhì)緩沖液一般分為樣品制備的裂解液和上樣緩沖液。樣品緩沖液的配方多種多樣，對(duì)于不同樣品的蛋白質(zhì)，緩沖液的成分和濃度會(huì)有所不同。對(duì)于某一特定樣品的蛋白質(zhì)，要想達(dá)到最佳分離效果，必須對(duì)緩沖液的成分和濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)、調(diào)整。本研究最初應(yīng)用了不適合的血清蛋白上樣緩沖液，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果較差（圖3A）。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整，目前筆者應(yīng)用的上樣緩沖液成分是7mol／L尿素、2mol／L硫脲、4%CHAPS、50mmol／L DTT、2mmol／L TBP、0.2%IEF buffer pH3～10、痕量溴酚藍(lán)，能夠達(dá)到較好電泳效果（圖3B）。

圖3 血清蛋白質(zhì)緩沖液對(duì)2－DE的影響

2.5 血清蛋白質(zhì)的純化 丙酮沉淀蛋白質(zhì)的方法，被廣泛用于蛋白質(zhì)標(biāo)本的預(yù)處理純化，可以去除鹽、脂、核酸等雜質(zhì)的干擾，可以富集低濃度蛋白質(zhì)。而沉淀的方法會(huì)丟失少量的蛋白質(zhì)。所以本研究進(jìn)行了血清蛋白質(zhì)丙酮沉淀與不沉淀的比較。圖4A為經(jīng)過丙酮沉淀的血清蛋白2－DE圖，圖4B為未沉淀蛋白2－DE圖，二者的加樣量相同。通過比較可以發(fā)現(xiàn)兩張圖蛋白點(diǎn)極為相似。以后的實(shí)驗(yàn)中盡量采取不沉淀的方法，但如果血清鹽、脂等嚴(yán)重干擾等電聚焦電泳，則可以采取沉淀的方法純化標(biāo)本，去除干擾成分。

圖4 丙酮沉淀與不沉淀蛋白質(zhì)2－DE圖比較

本研究對(duì)肺癌血清蛋白質(zhì)2－DE的各種條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了重復(fù)性較好的血清蛋白質(zhì)2－DE技術(shù)，獲得了較穩(wěn)定的肺癌血清蛋白質(zhì)2－DE圖譜，為進(jìn)一步比較、分析、鑒定肺癌相關(guān)血清蛋白質(zhì)，開展相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］劉璟.肺癌治療的進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2011，24（1）：25.

［2］Aebersold R，Mann M.Mass spectrometry－based proteomics〔J〕.Nature，2003，422（6928）：198.

［3］Curreem SO，Watt RM，et al.Two－dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics〔J〕.Protein Cell，2012，3（5）：346.

［4］G?rg A，Weiss W，Dunn MJ.Current two－dimensional electrophoresis technology for proteomics〔J〕.Proteomics，2004，4（12）：3665－3685.