牦牛葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆測序及在肌肉中的表達

金素鈺+王國生+徐亞歐+林亞秋+鄭玉才

摘要：采用RT-PCR方法克隆九龍牦牛（Bos grunniens）肌肉中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）和單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白（MCT）基因GlUT4、MCT1和MCT4的cDNA序列，并與普通牛（Bos taraus）進行基因序列和肌肉中mRNA水平的比較，以探索牦牛適應(yīng)高原低氧的分子基礎(chǔ)。結(jié)果表明，GlUT4、MCT1和MCT4的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列與普通牛的相似性均在99.5%以上。實時熒光定量PCR分析顯示，成年九龍牦牛與黃牛背最長肌中GLUT4、MCT4基因 mRNA 水平無差別，而牦牛PMCT1基因mRNA水平顯著低于黃牛（P<0.05）。乳酸脫氫酶（LDH）總活力和同工酶譜測定結(jié)果表明，牦牛背最長肌中LDH總活力、LDH5比例顯著高于黃牛，顯示出更強的無氧酵解能力。結(jié)合MCT1基因mRNA水平的差異發(fā)現(xiàn)，牦牛背最長肌對乳酸的氧化代謝能力低于黃牛，更傾向于無氧酵解，與其適應(yīng)高原低氧有關(guān)。

關(guān)鍵詞：九龍牦牛；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白；單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白；肌肉；低氧適應(yīng)；基因表達

中圖分類號：S823.8+52 文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0029-03

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有的牛種，對高寒、低氧等惡劣生態(tài)環(huán)境有良好的適應(yīng)性。低氧環(huán)境能導(dǎo)致細胞多種能量代謝通路的適應(yīng)性變化，例如無氧酵解增加，單位葡萄糖產(chǎn)生的能量減少，進而導(dǎo)致細胞膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）適應(yīng)性增加。肌肉組織中最重要的GLUT家族成員包括GLUT1和GLUT4，其中GLUT4是肌肉和脂肪細胞中的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白^[1]，存在于細胞內(nèi)，受胰島素、運動和缺氧等因素影響^[2-3]。肌肉是產(chǎn)生乳酸的主要組織，氧化型肌纖維（紅?。┖托募∧芤匀樗釣槿剂戏肿訛闄C體提供能量^[4]。在乳酸轉(zhuǎn)運進入細胞的過程中，單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白（MCT）發(fā)揮重要作用。MCT有多個家族成員，其中，在肌肉中表達的主要有MCT1、MCT2和MCT4，在乳酸轉(zhuǎn)運中發(fā)揮功能^[5-6]。MCT1在氧化型纖維中表達水平高，被認為在乳酸向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要的作用^[5]。Jurie等研究表明，低氧適應(yīng)能使肌肉組織在能量代謝方面更依賴于葡萄糖^[7]。因此，分析GLUT、MCT基因序列及其組織表達規(guī)律，對認識動物低氧適應(yīng)的分子機制是重要的切入點。目前，關(guān)于暫時性缺氧對GLUT、MCT基因表達影響的研究已有不少，但對于低氧馴化的牦牛組織中GLUT、MCT還未見報道。因此，試驗假設(shè)長期的低氧適應(yīng)可能導(dǎo)致牦牛GLUT、MCT基因序列或組織表達水平發(fā)生改變，重點分析九龍牦牛GLUT4、MCT1和MCT4的基因序列及其在肌肉中的表達特點，并與普通牛比較，以探索牦牛適應(yīng)低氧環(huán)境的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗所用九龍牦牛（Bos grunniens）樣品采自四川省甘孜州九龍縣，其中，0.5歲犢牛6頭，3.5～5.5歲牦牛10頭，7～10歲牦牛8頭。屠宰時，迅速采集背最長肌和股四頭肌，用錫箔紙包好，置于液氮內(nèi)帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆?。另外，從四川省青白江市某屠宰場采?頭成年黃牛背最長肌和股四頭肌樣本作為對照。

1.2 試劑及器材

主要儀器包括高速冷凍離心機（日立）、超聲波破碎儀（Sonics）、分光光度計（Cary 50，Varian）、電動勻漿器（PT-1200E，Kinematica）、凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc 2000，Bio-Rad）。熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex TaqTM（2×）購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司；2×LongTaq Mix、Trizol試劑均購自天根公司。引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆測序

取RNA 8 μL，用Random hexamer引物按Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)GenBank中普通牛GLUT4、MCT1和MCT4基因mRNA序列（序列號依次為AY458600、BC104598和NM_001109980），用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物。GLUT4-F：5′-CTAAGACAAGATGCCGTCG-3′，GLUT4-R：5′-TCAGTCATGCTCATCTGG C-3′；MCT1-F：5′-CGAGCCGCGTATAACGAT-3′；MCT1-R：5′-CCACAGGTTCAAACTGGACTCT-3′，MCT4-F：5′-CTTGGAACAGCCTCTGTCA-3′，MCT4-R：5′-GAGCGTTGACGGTCTCTG-3′。預(yù)期片段長度：GLUT4為1 540 bp，MCT1為 1 574 bp，MCT4為1 483 bp。PCR反應(yīng)體系：2×Long Taq Mix 12.5 μL，滅菌水 8.5 μL，正、反引物各1 μL，cDNA 2 μL。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃（GLUT4）/55 ℃（MCT1）/56 ℃（MCT4）1 min，72 ℃ 2 min，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后經(jīng)膠回收試劑盒純化，按常規(guī)基因克隆技術(shù)進行克隆，每個基因的陽性克隆取3～5個菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.4 定量PCR分析牦牛肌肉中GLUT4、MCT1和MCT4 mRNA 水平

根據(jù)獲得的九龍牦牛3個基因的cDNA序列，用Primer Premier 5.0軟件跨內(nèi)含子設(shè)計引物。GLUT4-F1：5′-TGGGGACACTCAATCAACT-3′；GLUT4-R1：5′-TCAGCCAACACCTCAGACA-3′，MCT1-F1：5′-AAACGCTGATGGACCTTG-3′；MCT1-R2：5′-TATGCCACATGCCCAGTA-3′；MCT4-F1：5′-GTCCACTGCCAGCAACTAC-3′，MCT4-R1：5′-AGCACCAGCACAAGGGA-3′。內(nèi)參基因的引物根據(jù)GenBank中普通牛GAPDH序列（NM_001034034）設(shè)計，GAPDH-F：5′-CACCCTCAAGATTGTCAGC-3′，GAPDH-R：5′-TCATAAGTCCCTCCACGAT-3′。根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明配制20 μL的反應(yīng)體系，其中，正、反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，58 ℃（GLUT4、GAPDH）/62 ℃（MCT1、MCT4）10 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。采用目的基因、內(nèi)參基因的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，目的基因的表達水平用內(nèi)參基因校正。

1.5 肌肉組織LDH總活力及其同工酶譜分析

準(zhǔn)確稱取0.2 g肌肉組織，加勻漿液（含10 mmol/L Tris、pH值為8.0，0.25 mol/L蔗糖，2 mmol/L EDTA）2.8 mL，用電動勻漿器在冰上勻漿30 s，取1 mL以轉(zhuǎn)速10 000 g于4 ℃離心10 min，參照Marchat等方法^[8]測定上清液LDH活力。酶活力的定義為：在25 ℃條件下，1 g新鮮組織1 min催化 1 μmol 底物轉(zhuǎn)化為1個單位。LDH同工酶采用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，酶活性染色^[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因的克隆測序

采用RT-PCR方法擴增九龍牦牛背最長肌的GLUT4、MCT1和MCT4基因，均得到1條特異的擴增條帶，并分別均與預(yù)期分子量大小相符（圖略）。測序結(jié)果證實得到了GLUT4、MCT1和MCT4等3個基因的編碼序列（CDS序列），并提交GenBank。

由表1可見，牦牛GLUT4基因（HM055486）CDS全長 1 530 bp，編碼509個氨基酸，與普通牛相比有5個堿基差異和1個氨基酸差異，牦牛第293位為Val（纈氨酸），而普通牛為Met（甲硫氨酸），核苷酸和氨基酸相似性分別為99.67%和99.8%；牦牛MCT1基因（HM061149）CDS全長1 506 bp，編碼501個氨基酸，與普通牛相比有6個堿基差異和2個氨基酸差異，牦牛第325位、354位分別為Iso（異亮氨酸）、Val（纈氨酸），而普通牛分別為Val、Iso，核苷酸和氨基酸相似性均為99.6%；牦牛MCT4基因（HM583655）CDS全長 1 386 bp，編碼460個氨基酸，與普通牛相比有6個堿基差異，核苷酸相似性為99.56%，但氨基酸序列完全相同。牦牛3個基因與普通牛的堿基差異類型主要是轉(zhuǎn)換。

2.2 牦牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因的發(fā)育譜

3個目的基因和內(nèi)參基因的實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線擴增效率為94.5%～102.9%，符合分析要求。在牦牛背最長肌和股四頭肌中，GLUT4、MCT1、MCT4 mRNA水平在各年齡段（0.5、3.5～5.5、7～10歲）均無顯著差異。

2.3 牦牛與黃牛肌肉GLUT4、MCT1、MCT4基因表達比較

實時熒光定量PCR分析顯示，成年九龍牦牛（n=10）與黃牛（n=8）背最長肌中，GLUT4、MCT4 mRNA水平無差別，MCT1 mRNA水平黃牛顯著高于牦牛（P<0.05，圖1）；而在股四頭肌中，GLUT4、MCT1、MCT4的mRNA水平均未見顯著差異。

2.4 肌肉組織LDH活力和酶譜

試驗結(jié)果表明，牦牛背最長肌中LDH總活力顯著高于黃牛[牦牛（510±30） U/mg，黃牛（407±35） U/mg]，而腿肌中LDH總活力接近[牦牛（305±31） U/mg，黃牛（282±47） U/mg]。由圖2可見，牦牛背最長肌中LDH5的比例顯著高于黃牛，而LDH2比例極顯著低于黃牛。股四頭肌中LDH同工酶比例無顯著差異。

3 結(jié)論與討論

酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與普通牛相似性很高，均在99.5%以上，與其他很多功能基因研究結(jié)果^[10-11]一致，這也說明牦牛與普通牛的親緣關(guān)系很近。牦牛和普通牛存在氨基酸差異的有2個基因GlUT4和MCT1，存在差異的氨基酸性質(zhì)相似（Val、Iso、Met），推測這些氨基酸的變化對相應(yīng)載體蛋白功能影響很小，GlUT4、MCT1和MCT4基因序列具有保守性。

年齡增長的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)在骨骼肌中MCT1和MCT4 mRNA水平隨年齡增加而發(fā)生不同程度的改變^[12]；Kirat等研究發(fā)現(xiàn)MCT1在成年牛肝臟的表達量極顯著高于犢牛^[13]。本試驗結(jié)果與Hatta等研究結(jié)論存在差異，原因尚不清楚。

有關(guān)低氧刺激對GLUT、MCT基因表達影響的研究已有很多報道。Wood等研究發(fā)現(xiàn)，低氧能提高人的脂肪細胞GLUT1水平，但不會改變GLUT4水平^[14]。Ullah等研究了體外培養(yǎng)的細胞（HeLa、COS、HL-1）中MCT1、 MCT2、MCT4對缺氧刺激的反應(yīng)，結(jié)果表明，MCT4 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均增加，MCT1和MCT2水平未見變化^[15]。本研究中由于牦牛對低氧的長期馴化，相關(guān)能量代謝機制可能與暫時性缺氧有所不同。

MCT1在氧化型纖維中表達水平高，幫助乳酸向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，參與乳酸的氧化利用^[5]。McCullagh等研究了MCT1的表達，證實MCT1在紅肌的表達與肌肉中乳酸吸收相關(guān)，與檸檬酸合成酶活性呈相關(guān)（肌肉氧化能力的標(biāo)志），這說明MCT1能促進肌纖維細胞對乳酸的吸收，與LDH（心型）及氧化代謝相關(guān)酶協(xié)同表達^[16]。由于LDH參與無氧酵解，而且LDH5傾向于將丙酮酸還原成乳酸^[17]。九龍牦牛背最長肌中MCT1 mRNA表達量顯著低于黃牛，背最長肌中LDH總活力、LDH5比例顯著高于黃牛，這說明牦牛背最長肌糖代謝中乳酸的氧化低于黃牛，更傾向于無氧酵解，與牦牛生活環(huán)境中的氧含量是相適應(yīng)的。然而，由于肌肉組織中可表達多種MCT^[18]，因此，牦牛和黃牛對乳酸的利用及其轉(zhuǎn)運的分子基礎(chǔ)比較，需要更加精細和全面的分析。

本試驗結(jié)果初步表明，牦牛GLUT4、MCT1和MCT4基因序列與普通牛相似性高；與普通牛比較，牦牛背最長肌中較低的MCT1 mRNA水平與其較強的無氧代謝能力相吻合，可能是牦牛從分子水平上適應(yīng)低氧環(huán)境的表現(xiàn)之一。

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