王愛紅，龐秋霞，陳美霓，米志寬，符兆英*，楊文杰，向云濤

(1延安大學醫(yī)學院生物化學教研室，延安716000;2延安大學醫(yī)學院;*通訊作者，E-mail:fu_zhaoying@163.com)

肺癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率均居首位［1，2］，從天然資源如植物或中藥中尋找提取毒副作用小的治療肺癌的藥物，有著特別重要的意義［3－6］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳漿大戟提取物具有誘導人肺癌A549細胞凋亡的作用，并對其作用機制做了初步研究，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

人肺癌細胞A549由延安大學醫(yī)學實驗中心實驗室保存。噻唑藍(MTT)、碘化丙錠(PI)、二甲亞砜(DMSO)(sigma－Aldrich公司，美國);RPMI 1640培養(yǎng)基(invitrogen公司，美國)，四季青新生小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco BRL公司，美國)，Trizol(invitrogen 公司，美國)，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司，加拿大);Bcl-2、Bax、β-actin 引物由上海生工設計合成，熒光倒置顯微鏡及CCD采用Nikon顯微鏡，流式細胞儀 FACS Calibur(Becton Dickinson公司，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE公司，美國)，酶標儀采用美國Bio－Rad 680型全自動酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)加入10%小牛血清，100 U/ml青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素。放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 乳漿大戟提取物制備 乳漿大戟地上全草陰干，用植物搗碎機粉碎，加適量純水制成混懸液，粗濾紙過濾收集濾液，低溫風干稱重，加純水配制成100 g/L，0.22μm濾器過濾保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MTT法檢測乳漿大戟提取物對人肺癌細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的A549細胞，以5×104/ml的密度接種于96孔板中，每孔200μl。次日細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，添加乳漿大戟提取物，其終濃度為0，0.2，0.4，0.8 g/L，每個濃度設 6 個復孔，于培養(yǎng) 24，48，72 h 加入 MTT 20 μl/孔(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)150μl/孔，充分混勻，在酶標儀490 nm處測其吸光度(A)值，計算平均A值和抑制率(IR)。試驗重復三次。IR=(1－實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.4 Hoechst33528和PI染色法觀察細胞形態(tài)學改變 取對數(shù)生長期的A549細胞，以2×105/ml的密度接種于6孔板中，每孔2 ml。次日細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，添加乳漿大戟提取物，其終濃度為0，0.2，0.4，0.8 g/L，培養(yǎng) 48，72 h 后棄去培養(yǎng)基，2 ml PBS洗二次，加入50 g/L的PI染料，避光染色30 min，Hoechst33528染色按照說明書進行，熒光顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)改變。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 流式細胞術樣品準備:①細胞處理方法同1.2.3，培養(yǎng)48 h后，消化收集細胞(1－5)×106個，500－1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。②3 ml PBS洗一次。③離心去除PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃，1 h。④離心棄去固定液，3 ml PBS重懸5 min。⑤400目的篩網過濾1次，500－1 000 r/min離心5 min，棄去PBS。⑥用1 ml PI染液，4℃避光30 min。⑦流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 細胞線粒體膜電位檢測 細胞處理同1.2.3，培養(yǎng)48 h后吸棄全部培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞一次，加1 ml培養(yǎng)液和1 ml JC染色工作液，充分混勻，在培養(yǎng)箱37℃孵育20 min;37℃孵育結束后，吸棄含染色液的培養(yǎng)液，用JC染色緩沖液洗滌2次;加入2 ml細胞培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

本實驗采用JC-1熒光探針法檢測細胞的線粒體膜電位，在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物產生紅色熒光，線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。正常的細胞膜電位較高，鏡下觀察為紅色;當出現(xiàn)凋亡時，膜電位下降，鏡下觀察為綠色。

1.2.7 RT-PCR 將 A549細胞接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，接種濃度為 3×105/ml，細胞處理方法同1.2.3。按Trizol試劑盒說明書操作提取總RNA，DEPC水溶解，取少量樣品進行紫外分光光度計定量和瓊脂糖凝膠電泳分析，－80℃保存。取1μg總RNA在20μl體系中逆轉錄合成cDNA，逆轉錄體系包括總 RNA 1μg、引物 oligo(dT)181μl、5×Reaction buffer 4 μl、RNase inhibition 1 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、Reverse Transcriptase1 μl、加水至20 μl，逆轉錄條件42 ℃1 h，70 ℃5 min，取2 μl cDNA產物在25μl反應體系中進行PCR儀中擴增，β－actin作為內對照，引物序列、大小及退火溫度見表1。PCR反應體系包括cDNA產物2μl、上游引物和下游引物各加1 μl、2×PCR mix 12.5 μl、水8.5 μl，混勻離心，放進梯度PCR儀，按以下條件擴增，94℃預熱3 min，94 ℃ 3 s，59.1 ℃(bax)、64.2 ℃(bcl－2)、61.8 ℃(β－actin)3 s、72 ℃1 min，共 30 個循環(huán)。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離，并用Gene凝膠成像系統(tǒng)進行照相及半定量分析。

表1 被檢測基因所使用的引物序列Table 1 Sequence of primers of target genes

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 乳漿大戟提取物對A549細胞增殖的影響

MTT法檢測結果顯示，用不同濃度乳漿大戟提取物處理細胞，細胞增殖被抑制，各時點各劑量組與對照組均差異有統(tǒng)計學意義，最大抑制率達46.3%(見表2)。

表2 MTT法測乳漿大戟提取物對A549細胞生長的抑制作用(n=18，±s)Table 2 Inhibition effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of A549 cell by MTT assay(n=18，±s)

表2 MTT法測乳漿大戟提取物對A549細胞生長的抑制作用(n=18，±s)Table 2 Inhibition effect of extracts of Euphorbia esula on proliferation of A549 cell by MTT assay(n=18，±s)

與對照組(0 g/L)相比，*P＜0.05;與0.2 g/L 組相比，△P＜0.05

0.4 g/L 0.342±0.055* 13.8±8.3△ 0.352±0.042* 41.9±2.6△ 0.523±0.038* 45.2±1.6△0.8 g/L 0.318±0.033* 19.2±3.9△ 0.326±0.046* 46.3±3.2△ 0.542±0.022* 43.1±2.8△

2.2 乳漿大戟提取物對A549細胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡下觀察對照組細胞飽滿呈梭形，胞質豐富，大小均一，單層貼壁生長，處理組的細胞減少，細胞間隙增大，貼壁狀態(tài)差，細胞變圓，細胞膜皺縮，折光性小，細胞脫落明顯(見圖1)。

圖1 乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h的細胞形態(tài)變化 (×100)Figure 1 Morphology of A549 cells after treated with 0.8 g/L extracts of Euphorbia esula for 48 h (×100)

圖2 乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h的細胞核染色質形態(tài)變化 (×100)Figure 2 Effects of on morphology of cell nuclear of A549 cells after treated with different concentrations of extracts of Euphorbia esula for 48 h (×100)

圖3 乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h的線粒體膜電位變化 (JC－1染色，×200)Figure 3 Changes of mitochondrial membrane potential of A549 cells after treated with extracts of Euphorbia esula for 48 h(JC－1 staining，×200)

Hoechst33528和PI染色結果顯示，正常對照組細胞的細胞核呈完整橢圓形，細胞數(shù)目多，幾乎無凋亡細胞;與對照組相比，處理組細胞核皺縮變形，細胞數(shù)目明顯減少，細胞體積變小、變圓，細胞核出現(xiàn)固縮，呈致密強熒光(圖2，見第548頁)。

2.3 乳漿大戟提取物對A549細胞凋亡的影響

流式細胞儀結果顯示，不同濃度的乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h后，可以誘導細胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，凋亡率增大，各個處理組的細胞凋亡率與正常對照組細胞相比有差異(P＜0.05，見表3)。

表3 乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h的凋亡率(n=3，±s)Table 3 Effect of extracts of Euphorbia esula on apoptosis of A549 at 48 h by flow cytometry (n=3，±s)

表3 乳漿大戟提取物作用A549細胞48 h的凋亡率(n=3，±s)Table 3 Effect of extracts of Euphorbia esula on apoptosis of A549 at 48 h by flow cytometry (n=3，±s)

與對照組(0 g/L)相比，*P＜0.05

0.4 g/L 組 21.42±1.01*0.8 g/L 組 46.57±1.76*

2.4 乳漿大戟提取物對A549細胞線粒體膜電位的影響

熒光顯微鏡下觀察可見對照組細胞呈紅色，表明線粒體膜電位正常，而處理組細胞多數(shù)呈綠色，表明線粒體膜電位下降，細胞凋亡，說明線粒體途徑參與乳漿大戟提取物誘導的細胞凋亡(圖3，見第548頁)。

2.5 bax和 bcl－2的 mRNA 表達

RT－PCR結果顯示，乳漿大戟提取物處理A549細胞，bax的 mRNA表達的逐漸增加，bcl－2的mRNA表達逐漸減弱(圖4A)。以內參照β－actin校正，以校正值為基因的表達豐度，bcl－2和bax的mRNA表達呈劑量－反應關系(圖4B)。

圖4 乳漿大戟提取物對A549細胞的bax、bcl－2 mRNA表達水平的影響Figure 4 Effect of extracts of Euphorbia esula on mRNA expression of bax and bcl－2 in A549 cells by RT-PCR

3 討論

我國的中草藥資源豐富，而且中草藥具有有效成分多、結構多樣、抗癌譜廣、副作用小、開發(fā)成本低等特點，日益受到國內外醫(yī)藥界的關注［7－9］。進入新世紀以來，在回歸大自然的觀念和醫(yī)療模式轉換的影響下，對天然藥物的探索與研究更加受到青睞，從天然產物中尋找保健預防和治療疾病的有效成分已經成了國際上的大潮流。有不少學者認為，天然藥物今后將會逐漸成為醫(yī)藥市場的主流［10－12］。

乳漿大戟(Euphorbia esula L.)是一種并不多見的植物，根據(jù)中國植物志［13］，乳漿大戟又稱貓眼草(中國高等植物圖鑒)，乳漿草(北京植物志)，華北大戟(秦嶺植物志)，新疆大戟(中國沙漠植物志)，太魯閣大戟(臺灣植物志)，岷縣大戟(云南植物研究)，寬葉乳漿大戟(東北草本植物志)，東北大戟，松葉乳汁大戟等。乳漿大戟為多年生草本，是國產大戟屬植物中分布最廣、變異幅度最大的種之一，分布于全國大部分地區(qū)，除海南、貴州、云南和西藏外。乳漿大戟全草入藥，具拔毒止癢之效。

我們采集乳漿大戟的地上全草，提取水溶性組分，經除菌過濾后，用人肺癌細胞A549作抑制細胞增殖和活力的MTT實驗、PI和Hoechst33528染色觀察細胞形態(tài)學改變、JC－1染色檢測細胞線粒體膜電位改變、并用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示，乳漿大戟提取物能抑制A549細胞的增殖，具有劑量效應關系，隨著時間延長，抑制作用增強，最大抑制率為46.3%;顯微鏡下觀察，乳漿大戟提取物處理后的A549細胞出現(xiàn)凋亡細胞的形態(tài)特征;JC－1染色顯示細胞線粒體膜電位下降，流式細胞檢測結果顯示乳漿大戟提取物可以誘導A549細胞凋亡，凋亡率可達48.4%。

我們進一步做了乳漿大戟提取物誘導細胞凋亡作用機制的初步研究，RT－PCR結果顯示，人肺癌A549細胞中bax表達上調、bcl－2表達下調，bax和bcl－2是細胞凋亡的重要調節(jié)因子，參與線粒體凋亡通路的調節(jié)。有研究表明，線粒體膜電位降低是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件之一［14］。線粒體膜電位下降與線粒體膜通透性(MPT)改變有關，MPT允許水和溶質進入基質，引起線粒體的膨脹，內膜的膨脹導致外膜的破裂，從而使Cyt C、smac/Diabod、AIF等與細胞凋亡有關的重要因子釋放到胞質中［l5］，使細胞整體結構破壞、功能紊亂，發(fā)生凋亡。bcl－2能穩(wěn)定細胞及線粒體膜，阻止細胞色素C釋放進入胞質而抑制細胞凋亡，bax以二聚體或多聚體形式結合到線粒體膜上，改變膜的通透性，引起細胞色素C釋放進入胞質，激活Caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡［16］。綜上所述，乳漿大戟提取物可能是通過線粒體途徑，上調bax的表達、下調bcl－2表達從而誘導A549細胞發(fā)生凋亡。

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