遠志及其近緣種的ITS序列分析及鑒定

樊 杰，白 妍，束明月

（山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原 030024）

遠志屬是一個世界性分布的大屬，尤以熱帶、亞熱帶為盛，約500種［1］。我國遠志屬有42種8變種，全國分布，以西南和華南地區(qū)最多［1-2］。遠志屬植物含有豐富的三萜皂苷、口山酮、寡糖酯類成分及其他活性成分，組成該屬植物生理活性的有效物質(zhì)群，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、益智、安定、解毒消腫、補益強壯等作用［3-4］。在臨床和民間常用于心神不安、驚悸、失眠健忘、咳痰不爽、瘡瘍腫毒等。其中，遠志和卵葉遠志是中藥遠志的基源植物［5］，二者從植物形態(tài)到藥材鑒定均不易區(qū)別［6］。瓜子金在外部形態(tài)上與這2個種非常類似，但化學(xué)成分略有不同［3］。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列在藥用植物的分子鑒定、遺傳多樣性等方面有大量研究［7-8］，本研究通過測定ITS序列，分析卵葉遠志、遠志和瓜子金的差異，為這3種藥用植物的分子鑒定，為藥材遠志基源植物的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

遠志采自山西靈丘，常溫下自然干燥并保存1年；從Genbank數(shù)據(jù)庫獲得另外2個種的2條ITS序列和遠志的另外2條ITS序列，結(jié)果見表1。

1.2 DNA的提取方法

DNA的制備采用改良CTAB法［9］，略作改動，具體為：稱取約0.1g葉片，在提前-20℃預(yù)冷的研缽中研磨成粉末后用于DNA的提取。水浴溫度45℃，水浴5～6h，加異丙醇沉淀1h。

表1 樣品來源及ITS序列信息

1.3 PCR擴增及測序

ITS片段均無法1次完成PCR擴增，所以分為ITS1和ITS22段擴增，引物參考文獻［10］中的引物，使用的引物包括 ITS forward：5′-cga gaa gtc cac tga acc tta tc-3′，ITS reverse：P1：5′-tct tyt cct ccg ctt att gat atgc-3′和 ITS internal reverse：5′-gcg ttc aaa gac tcg atg gtt c-3′，ITS internal forward：5′-gac tct cgg caa cgg ata tct cggc-3′。PCR反應(yīng)在 PTC-200型PCR儀上進行。PCR總體積為25μL，包括：12.5μL Mix（Takara Premix Taq），10μm 引物各 0.5μL，0.5～1μL 模板（10～50ng），用滅菌超純水補足反應(yīng)體積。擴增程序為：94℃，3min；33個循環(huán)：94℃，1min；58℃，1min；72℃，1min 20s；72℃，6min。PCR 產(chǎn)物10μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送華大基因測序。

1.4 序列提交與分析

序列通過Sequin軟件提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，并獲得相應(yīng)登錄號。ClustalX 1.81軟件用于序列比對，采用MEGA 3.1軟件計算遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列比較

測序結(jié)果表明，序列中除ITS1和ITS2的全長外，還包含5.8S、18S和28S的部分序列，遠志的ITS序列已提交至NCBI，Genbank登錄號見表1。序列分析結(jié)果表明，遠志屬3種藥用植物ITS1長度為269～271bp，G＋C 量為 63.1%～63.4%；ITS2的長度為216～217bp，G＋C 量為64.4%～65.0%。結(jié)果見表2。

表2 遠志屬3種藥用植物ITS序列長度和G+C含量

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA 3.1軟件計算ITS的變異位點及信息位點，結(jié)果表明，5.8S基因無變異；ITS1序列有19個變異位點，占總位點數(shù)的6.76%，其中17個是由于瓜子金單堿基突變造成的，另2個是由于山西靈丘的遠志樣品單堿基缺少造成的，無信息位點，Genbank下載的2個遠志序列與卵葉遠志序列無差異；ITS2序列有7個變異位點，占總位點數(shù)的3.02%，其中6個為瓜子金的單堿基變異造成的，信息位點僅1個，山西靈丘遠志有1個單堿基缺失，卵葉遠志序列和Genbank下載的2個遠志序列完全一致。

利用MEGA 3.1的Kimura 2-parameter計算3種藥用植物之間的遺傳距離。結(jié)果表明，瓜子金與其他2個種的距離最遠，均為0.038；其次為山西靈丘遠志樣品；遠志來自Genbank的2個樣品與卵葉遠志之間的遺傳距離最小，為0.000，關(guān)系最近（表3）。

表3 遠志屬3種藥用植物的遺傳距離

基于ITS序列，采用NJ法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），經(jīng)1000次自舉檢測，結(jié)果表明，遠志的3個樣品分為2支，Genbank的2個樣品與卵葉遠志聚為1支，山西靈丘遠志樣品單獨為1支，瓜子金單獨為1支。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

山西靈丘遠志樣品和另外2個來自Genbank的樣品存在遺傳差異性，說明遠志存在種下變異。已有的ISSR研究發(fā)現(xiàn)，遠志不同居群之間存在遺傳差異性，這在一定程度上佐證了我們的結(jié)論［7，11］。

ITS序列分析技術(shù)具有技術(shù)簡單、結(jié)果準確、重復(fù)性好等優(yōu)點，近年來廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定，是藥學(xué)研究中的一種重要分子標記［12］。其中ITS2被認為比ITS1具有更多的信息位點，具有更高的鑒定效率［13］。我們的研究支持這一觀點，ITS1含有19個變異位點，占總位點數(shù)的6.76%，但無信息位點；ITS2序列存在7個變異位點，占總位點數(shù)的3.02%，有1個信息位點。

卵葉遠志和遠志同為藥材遠志的基源植物［5］，兩者在形態(tài)上十分相似，藥材也較難區(qū)別［6］。通過比較它們的ITS序列，發(fā)現(xiàn)卵葉遠志和2個Genbank下載的遠志序列無差異，但與山西靈丘遠志存在差異，這與形態(tài)特征是一致的。

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