王著敏，金 杰

(1.河南省第二人民醫(yī)院，河南 鄭州451191;2.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)的長(zhǎng)期虛弱性疲勞嚴(yán)重影響患者的日常工作和生活質(zhì)量。目前CFS的病因不清，臨床尚無(wú)治療CFS的有效藥物。從目前公認(rèn)的CFS診斷標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，診斷依據(jù)主要為患者的主訴，沒(méi)有客觀(guān)的體征和實(shí)驗(yàn)室檢查、影像學(xué)資料，較符合中醫(yī)學(xué)審證求因、辨證論治的整體觀(guān)的認(rèn)知疾病方式。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)紅景天治療慢性疲勞大鼠的功能進(jìn)行初步的研究，從心理—免疫調(diào)節(jié)角度觀(guān)察紅景天對(duì)慢性疲勞大鼠的影響，為今后進(jìn)一步闡明紅景天治療CFS的作用機(jī)制及其在臨床中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SYXX(豫)2005－0012。大鼠自然進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)在正常光照、室溫(20±2)℃、相對(duì)濕度40%的環(huán)境中，5只/籠。適應(yīng)5 d后，稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，按數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、紅景天組、歸脾丸組4組，每組10只。

1.2 藥品、試劑與儀器

圣地紅景天(諾迪康膠囊)為西藏紅景天藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字 Z10980020，批號(hào)060403，規(guī)格0.28 g/粒。歸脾丸為河南省宛西制藥股份有限公司產(chǎn)品，國(guó)藥準(zhǔn)字 Z41021897，批號(hào)060802，每8丸相當(dāng)于原藥材3 g。NK cell免疫組織化學(xué)試劑盒、正常封閉血清和DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;Elivision plus試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)kit5901。BS210s型電子天平，d=0.001 g，Sarlorius公司產(chǎn)品;DS－671型電子天平，上海寺岡電子有限公司產(chǎn)品;CRM440型切片機(jī)，日本櫻花公司產(chǎn)品;BX51型萬(wàn)能顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品;SSCDC483P型圖像采集系統(tǒng)，日本Sony公司產(chǎn)品;Image－proplus 6.0圖像分析軟件系統(tǒng)，美國(guó) Media Cybernetics公司產(chǎn)品;束縛筒，自制，管狀，長(zhǎng)18 cm，內(nèi)徑5.8 cm，筒前端有1個(gè)內(nèi)徑1.8 cm的通氣口;自制敞箱，80 cm×80 cm×33 cm，周壁為黑色，底面用藍(lán)線(xiàn)劃分為面積相等的25個(gè)方塊。

1.3 模型的建立

冷水游泳:大鼠游泳時(shí)水深36 cm(游泳池規(guī)格80 cm×50 cm×50 cm)，水溫(16±1)℃，時(shí)段不定，每次游泳持續(xù)7 min。束縛操作:大鼠頭向通氣口置入自制束縛筒后，抵住其后端，限制其活動(dòng)，每次束縛30 min。

造模之日起，除正常對(duì)照組外，其余3組單號(hào)日期進(jìn)行冷水游泳，雙號(hào)日期進(jìn)行夾尾激怒(每次夾尾30 min)，并每日進(jìn)行束縛。造模時(shí)間為21 d。在整個(gè)造模過(guò)程中，正常對(duì)照組與其余3組處于同一環(huán)境中。

1.4 給藥劑量與方法

從造模之日始，正常對(duì)照組給予普通飼養(yǎng);模型對(duì)照組按3 mL/只給予生理鹽水灌胃;紅景天組按168 ng/(g·d)給予圣地紅景天混懸液灌胃;歸脾丸組按900 ng/(g·d)給予歸脾丸混懸液，灌胃。均1 d 1次，連續(xù)21 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

脾臟質(zhì)量和脾臟NK cell平均光密度值。

1.5.1 取 材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 g/L烏拉坦(400μg/g)麻醉大鼠，在實(shí)驗(yàn)室工作臺(tái)上迅速剖開(kāi)腹腔，連同周?chē)倭拷M織一起取出脾臟，浸入生理鹽水中洗凈附著的血液，剔除殘余的周?chē)M織，用濾紙吸干表面水分，放在電子天平上稱(chēng)量質(zhì)量并記錄。取出脾臟中段，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)100 g/L甲醛溶液中保存。

1.5.2 檢測(cè)方法

常規(guī)制備石蠟切片:①固定脾臟組織塊，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。②切片用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇至水洗。二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min→1 000 g/L乙醇2 min→950 g/L的乙醇1 min→900 g/L的乙醇1 min→800 g/L乙醇1 min→750 g/L乙醇1 min→蒸餾水洗2 min。③蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗。④鹽酸乙醇分化30 s(提插數(shù)下)。⑤ 自來(lái)水浸泡15 min。⑥置伊紅液2 min。⑦脫水，透明，封片。950 g/L乙醇(I)1 min→950 g/L乙醇(Ⅱ)1 min→1 000 g/L乙醇(I)1 min→1 000 g/L乙醇(Ⅱ)1 min→二甲苯石碳酸(3∶1)1 min→二甲苯(I)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min→中性樹(shù)脂封固。

免疫組織化學(xué)染色:采用免疫組織化學(xué)Elivision法，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果判定:以細(xì)胞漿中黃色顆粒為NK cell的陽(yáng)性表達(dá)，以陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值表示NK cell表達(dá)強(qiáng)度。

計(jì)算機(jī)圖像分析:采用SSC－DC483P圖像采集系統(tǒng)，關(guān)閉自動(dòng)白平衡功能，固定光源光圈以統(tǒng)一圖像采集條件;先在低倍鏡(10×10)下全面觀(guān)察切片以確定陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域，然后于高倍鏡(10×40)下取5個(gè)視野，分別采集圖像并保存。采用Image-proplus 6.0軟件分析系統(tǒng)測(cè)量圖像:矯正光密度后于各組圖像中各挑選一張典型圖片選色及分析測(cè)量，并按其操作程式編制各組宏，運(yùn)行各組宏批量分析各組圖片，測(cè)量平均光密度值，該值代表NK cell表達(dá)強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脾臟質(zhì)量對(duì)比

與模型對(duì)照組對(duì)比，正常對(duì)照組、紅景天組、歸脾丸組大鼠脾臟質(zhì)量增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與正常對(duì)照組對(duì)比，紅景天組脾臟質(zhì)量減輕，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);歸脾丸組脾臟質(zhì)量減輕，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與歸脾丸組對(duì)比，紅景天組脾臟質(zhì)量增加，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脾臟質(zhì)量對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠脾臟質(zhì)量對(duì)比 ±s

注:與正常對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，##P ＜0.01。

/g正常對(duì)照組 10 1.94 ±0.18組 別 動(dòng)物數(shù) 脾臟質(zhì)量##模型對(duì)照組 10 1.02 ±0.42＊＊?dú)w脾丸組 10 1.43 ±0.20＊＊##紅景天組 10 1.63 ±0.39*##

2.2 各組大鼠脾臟NK cell陽(yáng)性表達(dá)測(cè)定結(jié)果對(duì)比

與模型對(duì)照組對(duì)比，正常對(duì)照組、紅景天組、歸脾丸組NK cell平均光密度值減小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與正常對(duì)照組對(duì)比，紅景天組NK cell平均光密度值增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);歸脾丸組NK cell平均光密度值增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與歸脾丸組對(duì)比，紅景天組NK cell平均光密度值降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠脾臟NK cell陽(yáng)性表達(dá)測(cè)定結(jié)果對(duì)比

3 討論

免疫功能異常包括自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒活性降低，淋巴細(xì)胞對(duì)致有絲分裂原反應(yīng)減弱和生成的細(xì)胞因子改變，以及單核細(xì)胞吞噬作用減弱;因此，也稱(chēng)該病為慢性疲勞免疫功能障礙綜合征。

NK細(xì)胞是與T、B細(xì)胞并列的第三類(lèi)群淋巴細(xì)胞，在脾內(nèi)占3% ～4%。NK細(xì)胞的功能主要有自然殺傷活性，靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞(包括部分細(xì)胞系)、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞(如血細(xì)胞)、寄生蟲(chóng)等，殺傷介質(zhì)主要有穿孔素、NK細(xì)胞毒因子和TNF等;因此，NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Ⅱ型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)［1－2］。

慢性應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)體自由基代謝異常，過(guò)量的自由基聚集，促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷淋巴細(xì)胞DNA，進(jìn)而抑制免疫功能，破壞免疫器官(脾)［3］。NK是機(jī)體極為活躍的免疫調(diào)節(jié)因素，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:慢性疲勞模型動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)水平較正常動(dòng)物明顯降低。模型對(duì)照組的脾臟質(zhì)量、脾臟NK細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)與正常對(duì)照組對(duì)比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。這些變化可能是慢性疲勞綜合征發(fā)生的病理機(jī)制之一。在增加脾臟質(zhì)量、脾臟NK細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)方面，紅景天治療的作用優(yōu)于歸脾丸，說(shuō)明紅景天具有免疫增強(qiáng)和免疫調(diào)節(jié)作用;這可能是紅景天發(fā)揮扶正固本、調(diào)和陰陽(yáng)、補(bǔ)益氣血功效，治療慢性疲勞綜合征的機(jī)制之一。

［1］王勝旺，王福慶.NKT 細(xì)胞［J］.上海免疫學(xué)雜志，2002，22(3):210－212.

［2］Kuwatani M，Ikarashi Y，IizukaA，et al.Modulation of acute graft-versus-host disease and chimerism after adoptive transfer of in vitro－expanded invariant Valpha14 natural killer T cells［J］.Immunol Lett，2006，106(1):82 －90.

［3］劉繼文，袁方，連玉龍，等.慢性應(yīng)激對(duì)大鼠免疫功能損傷機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2007，24(6):599－602.