李美荃，宋 聰，張春勇，安清聰，潘洪斌，陳克嶙，郭榮富

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201）

在云南高原立體環(huán)境下，自繁自養(yǎng)的本地雞種通過(guò)生物進(jìn)化形成了獨(dú)特的優(yōu)質(zhì)特性。云南地方雞種肉香味美、肉質(zhì)細(xì)嫩，抗病力強(qiáng)，抗氧化特性較培育雞種高。謝強(qiáng)明等研究報(bào)道，普洱瓢雞生長(zhǎng)在海拔較高、氣候冷涼的山區(qū)，具有體型矮小細(xì)致的體征特點(diǎn)，瓢雞腹脂較厚、易于沉積脂肪，肉味細(xì)嫩鮮美［1］。沈雪鷹等調(diào)查報(bào)道，騰沖雪雞產(chǎn)于冬季積雪的高黎貢山西麓，羽毛潔白、肉骨烏黑，肉質(zhì)鮮美香甜，騰沖雪雞對(duì)一般疾病如雞白痢、球蟲(chóng)病有較強(qiáng)的抵抗力，是我國(guó)地方優(yōu)良雞種［2］。谷氧還蛋白（glutaredoxin，GRX）和硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）是抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)的重要成員，在抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，具有維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)、抗衰老及腸道保護(hù)生物學(xué)效應(yīng)等作用［3］。Lundberg等［4］報(bào)道，GRX 家族逐漸擴(kuò)大，新的GRX 成員不斷被發(fā)現(xiàn)，如谷氧還蛋白1（GRX1）、谷氧還蛋白2（GRX2）。Kim M J等研究報(bào)道，1型半胱氨酸的cMsrA 是通過(guò)GRX 再生的［5］。目前在硫氧還蛋白家族（TRXs）中，主要有TRX1 和TRX2兩型，在細(xì)胞抗氧化能力方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)旨在探討不同雞種間抗氧化基因的差異，為提高其抗氧化能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)以云南特有同日齡健康普洱瓢雞、騰沖雪雞為研究對(duì)象，以三黃雞為試驗(yàn)對(duì)照，相同日糧和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，雞場(chǎng)實(shí)施正常免疫程序和飼養(yǎng)管理。每個(gè)試驗(yàn)雞種各隨機(jī)取12只體重相近的雞（1／2♂；1／2♀），共36只試驗(yàn)雞屠宰備用。

1.2 樣品收集

采用頸部錯(cuò)位法屠宰試驗(yàn)雞，屠宰后立即取其十二指腸、回腸、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、皮膚、肌肉共八個(gè)組織，于－80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT－PCR

1.3.1 不同品種雞組織總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄使用TRIzol法提取組織RNA（按照說(shuō)明書(shū)操作），并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法和分光光度計(jì)檢測(cè)法進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。采用PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA 置于－20 ℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) RT－PCR 擴(kuò)增引物根據(jù)Gen－Bank提供的mRNA 序列使用Primer Premier（5.0）軟件設(shè)計(jì)，如表1所示。由上海生工生物工程設(shè)計(jì)服務(wù)有限公司合成。

表1 qRT－PCR引物信息Table 1 Information of Primers used for qRT－PCR

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Eva GreenⅠ染料法，反應(yīng)在Bio－Rad CFX96TM Real－Time PCR Systems上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20μL：SsoFastTM EvaGREEN○RSupermix 10μL（BIO－RAD，美國(guó)），上下游引物（10μmol／L）各1.0μL，cDNA 模板2.0 μL，加滅菌去離子水至20μL。樣品分裝于96孔板（BIO－RAD，美國(guó)）中，可透光蓋（BIO－RAD，美國(guó)）蓋緊。TRX1反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min；95 ℃、5s，57 ℃、20s，72 ℃、15s，40個(gè)循環(huán)。GRX1反應(yīng)條件為：95 ℃，10min；95 ℃、5s，59 ℃、20s，72 ℃、15s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有組織低氧適應(yīng)基因的表達(dá)量均是以GAP－DH、18s、β－actin為內(nèi)參基因，最終以相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示，相對(duì)熒光定量計(jì)算方法采用Pfaffl M.W.［6］方法計(jì)算而來(lái)。所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRX1與GRX1品種間基因表達(dá)差異

普洱瓢雞、騰沖雪雞所有組織的TRX1、GRX1基因mRNA 表達(dá)量高于三黃雞，普洱瓢雞大部分組織的TRX1、GRX1基因mRNA 表達(dá)量高于騰沖雪雞（圖1）。

圖1 普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞TRX1（a），GRX1（b）基因的差異表達(dá)Fig.1 Difference of TRX1（a），GRX1（b）gene expression in Puerpiao，Tengchongxue and Sanhuang chicken

2.2 TRX1與GRX1組織間基因表達(dá)差異

普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞所有組織中TRX1基因mRNA 表達(dá)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GRX1基因mRNA表達(dá)量（如圖2 所示）。其中，腎臟中的TRX1、GRX1表達(dá)差異最為顯著（P＜0.01）。普洱瓢雞組織的TRX1基因mRNA 表達(dá)量最高的是腎臟和肝臟，表達(dá)量最低的是心臟和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。普洱瓢雞組織的GRX1 基因mRNA 表達(dá)量最高的是肺臟和肝臟，表達(dá)量最低的是心臟和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。騰沖雪雞組織的TRX1基因mRNA 表達(dá)量最高的是腎臟和肺臟，表達(dá)量最低的是回腸和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。騰沖雪雞組織的GRX1 基因表達(dá)量最高的是肝臟和十二指腸，表達(dá)量最低的是肌肉和心臟，差異極顯著（P＜0.01）。三黃雞組織的TRX1 基因mRNA表達(dá)量最高的是腎臟和肺臟，表達(dá)量最低的是回腸和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。三黃雞組織的GRX1基因mRNA 表達(dá)量最高的是十二指腸和回腸，表達(dá)量最低的是皮膚和肌肉，差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

3.1 TRX1、GRX1的抗氧化應(yīng)激生物學(xué)效應(yīng)

細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)與細(xì)胞分化、細(xì)胞免疫、生長(zhǎng)抑制、腫瘤發(fā)生以及凋亡密切相關(guān)［7］。GRX 是由Holmgren等在缺失TRX 基因的大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)的，是一類依賴GSH 的氧化還原酶，在細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡狀態(tài)的調(diào)控及抵抗氧化應(yīng)激損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用［8］。TRX 于1964年在大腸桿菌中首次被發(fā)現(xiàn)，是一種內(nèi)生的抗氧化劑，在組織的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶被耗盡后可能發(fā)揮關(guān)鍵性作用［9］。GRX 和TRX 在細(xì)胞分化、細(xì)胞免疫、生長(zhǎng)抑制、腫瘤以及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的抗氧化作用［10］。

圖2 普洱瓢雞TRX1、GRX1（a）、騰沖雪雞TRX1、GRX1（b）、三黃雞的TRX1、GRX1（c）基因表達(dá)差異Fig.2 Difference of GRX1and TRX1gene expression for Puerpiao（a），Tengchongxue（b），Sanhuang（c）chicken

3.2 TRX1、GRX1基因在不同品種間的差異表達(dá)

本地雞種普洱瓢雞、騰沖雪雞的TRX1、GRX1含量顯著高于三黃雞；而云南地方雞種騰沖雪雞和普洱瓢雞之間，其TRX1、GRX1的含量與普洱瓢雞也存在差異，普洱瓢雞大部分組織的TRX1、GRX1基因mRNA 表達(dá)量高于騰沖雪雞。普洱瓢雞生長(zhǎng)在海拔較高、氣候冷涼的山區(qū)，由于長(zhǎng)期處于小群封閉、自繁自養(yǎng)狀態(tài)，沒(méi)有外來(lái)雞種的混雜，通過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇而成。騰沖雪雞產(chǎn)于山頂常年積雪的高黎貢山西麓，是云南省優(yōu)良地方雞種資源［11］。由于云南高海拔低氧氣候，地方雞種為了適應(yīng)缺氧環(huán)境故其抗氧化能力強(qiáng)于培育雞種三黃雞。

3.3 TRX1與GRX1基因表達(dá)差異

GRX 作用于抗氧化酶系統(tǒng)，TRX 作用于抗氧化非酶系統(tǒng)［12］。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶物質(zhì)大都屬于大分子物質(zhì)，非酶系統(tǒng)主要包括維生素C、谷胱甘肽等小分子物質(zhì)［13］。試驗(yàn)結(jié)果顯示，普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞所有組織的TRX1基因的mRNA表達(dá)量比GRX1 基因的mRNA 表達(dá)量高，但動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)作用機(jī)理復(fù)雜，因此并不能說(shuō)明動(dòng)物機(jī)體內(nèi)TRX1 的抗氧化作用大于GRX1。TRX1和GRX1的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.4 TRX1、GRX1基因在不同組織間表達(dá)差異

腎臟是對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感的器官之一，ROS對(duì)腎臟有直接的損傷作用。細(xì)胞中的活性氧是導(dǎo)致生物氧化脅迫的一個(gè)主要方面。而TRX 與硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）及NADPH 共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng)參與眾多生理過(guò)程［14］。TRX 可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)被氧化的二硫鍵的還原來(lái)修復(fù)機(jī)體的氧化損傷［15］。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)通過(guò)大量表達(dá)TRX1 使腎臟免于氧化應(yīng)激損傷［16］。Sugama K 等報(bào)道TRX 與腎小管損傷有關(guān)，且影響IL－10水平［17］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示普洱瓢雞、騰沖雪雞、三黃雞的腎臟內(nèi)的TRX1 含量高于其他組織，而GRX1表達(dá)與其他組織差異不明顯，可說(shuō)明在腎臟內(nèi)參與抗氧化的蛋白質(zhì)主要是TRX。大量ROS產(chǎn)生會(huì)造成組織細(xì)胞的損害，而肺臟是最易受損的靶器官之一。其中ROS可與蛋白質(zhì)中的色氨酸、組氨酸和半胱氨酸等殘基反應(yīng)，破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能，使含有這些氨基酸的蛋白質(zhì)、酶和受體等功能受損［18］。GRX 催化依賴谷胱甘肽的二硫化物氧化還原過(guò)程，通常發(fā)生在GRX 上被其他氨基酸隔開(kāi)的兩端半胱氨酸上［19］，半胱氨酸的表達(dá)直接影響谷氧還蛋白的表達(dá)與作用。ROS引起的肺損傷攻擊半胱氨酸，導(dǎo)致谷氧還蛋白表達(dá)低。Cao等研究報(bào)道，GGA 能夠保護(hù)由TRX 引起的肺臟缺血再灌注損傷［20］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，瓢雞的GRX1表達(dá)高于雪雞與三黃雞的，與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果相一致，瓢雞肺臟受ROS攻擊最小。為了維持肺臟的基本功能和氧化還原平衡，抵制ROS對(duì)半胱氨酸的攻擊，故而肺臟的GRX1含量相較其他組織要高。

肝臟在代謝過(guò)程中可不斷產(chǎn)生一些氧化活性物質(zhì)（ROS）。肝臟的抗氧化防御系統(tǒng)有四類：酶促防御機(jī)制、硫氧化還原蛋白和過(guò)氧化還原蛋白、低分子量的抗氧化劑和金屬結(jié)合蛋白［21］。谷氧還蛋白系統(tǒng)主要存在于胞漿和線粒體中，硫氧還蛋白還原系統(tǒng)主要存在于包漿中。故而肝臟的GRX1、TRX1表達(dá)較之其他組織要高很多，其在氧化還原中具有重要意義。Qin 等報(bào)道，高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷，TRX／TrxR 系統(tǒng)是其產(chǎn)生氧化應(yīng)激的主要因素［22］。

腸道是動(dòng)物消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能性器官，同時(shí)它還具有內(nèi)分泌、免疫、粘膜屏障等作用［23］。同時(shí)腸道是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，腸道系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)通常會(huì)降低畜禽機(jī)體的抗氧化能力，從而引起某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收障礙，尤其是在脂溶性維生素的吸收方面［24］。腸粘膜本身含有高濃度的非蛋白質(zhì)巰基，自由基作用于巰基導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶失活，自由基還能與膜內(nèi)的多不飽和脂肪酸結(jié)合造成脂質(zhì)過(guò)氧化損害［25］。因此，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，腸道是極易造成過(guò)氧化損傷的器官之一。與其他器官相比，腸道的GRX1、TRX1表達(dá)量相對(duì)較低也顯示腸道的過(guò)氧化損傷相對(duì)較嚴(yán)重。

4 結(jié)論

普洱瓢雞的GRX1、TRX1基因mRNA 表達(dá)水平高于騰沖雪雞，騰沖雪雞的GRX1、TRX1 基因mRNA 表達(dá)水平顯著高于三黃雞。普洱瓢雞、騰沖雪雞各組織中的TRX1、GRX1的表達(dá)量均高于三黃雞；TRX1 在三個(gè)雞種中的表達(dá)量顯著高于GRX1，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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