聶慧瓊，王平

[安徽醫(yī)科大學(xué)杭州臨床學(xué)院（杭州市第三人民醫(yī)院），杭州310009]

黑素細(xì)胞是人類皮膚重要組成細(xì)胞，司職黑素形成與代謝。皮膚黑素代謝是非常復(fù)雜而精細(xì)的過程，其參與的調(diào)節(jié)分子和信號傳導(dǎo)通路較多，相互影響。最近研究發(fā)現(xiàn)，自噬在黑素代謝過程中起著重要作用，參與調(diào)控黑素小體形成、成熟及破壞過程。筆者對自噬在黑素代謝中的作用，及自噬與色素性疾病和黑素瘤的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 黑素細(xì)胞自噬及其調(diào)控機制

自噬是指膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體（Autophagosome），并與內(nèi)涵體（Endosome） 形成所謂的自噬內(nèi)涵體（Amphisomes），最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體（Autophagolysosome），降解其所包裹的內(nèi)容物[1]。比利時科學(xué)家Christian de Duve 在上世紀(jì)50 年代通過電鏡觀察到自噬結(jié)構(gòu)，并于1963 年首次提出了“自噬”這一概念。根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運送到溶酶體內(nèi)的途徑不同，自噬可分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬，通常我們所說的自噬是指巨自噬。目前普遍認(rèn)為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機制，正常量的自噬水平降解受損和老化的細(xì)胞器從而對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起到重要作用，但過多或過少的自噬都對細(xì)胞有害。

黑素小體作為一種溶酶體相關(guān)細(xì)胞器，在黑素細(xì)胞中發(fā)揮黑素合成、儲存及轉(zhuǎn)運的重要作用[2]。越來越多的研究表明，自噬在黑素小體生成過程中起著關(guān)鍵作用。全基因組RNAi 研究發(fā)現(xiàn)3 個自噬調(diào)控因子MAP1LC3C、WIPI1 和GPSM1 是黑素合成的新調(diào)控因子。敲除自噬相關(guān)基因MAP1LC3C、BECN1 后可導(dǎo)致黑素生成減少，而免疫熒光檢測還發(fā)現(xiàn)，自噬小體和黑素小體標(biāo)記物有重疊部分[3]。慢性抑制WIPI1，黑素小體數(shù)量增加，提示自噬可調(diào)控黑素小體合成[4]。

1.1 黑素細(xì)胞自噬與黑素生成

1.1.1 黑素細(xì)胞自噬基因 自噬相關(guān)基因（autophagy-Aelatedgene,ATG）的克隆始于酵母，參與自噬調(diào)控過程。研究顯示，敲除黑素細(xì)胞關(guān)鍵的自噬基因，特別是WIPI，BECN1 和mTOR，將導(dǎo)致黑素增加。

WIPI1 是調(diào)控自噬小體代謝更新的自噬相關(guān)基因，在酵母中同源Atg18。Genesan 等[3]通過對WIPI1基因進(jìn)行過表達(dá)和RNA 干擾技術(shù)，在黑素瘤細(xì)胞株MNT-1 和正常黑素細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，WIPI1 可調(diào)控黑素細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子——小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）和黑素合成關(guān)鍵酶——酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄。而另有研究發(fā)現(xiàn)[4]，敲除mTOR 或藥物性抑制TORC1活性可導(dǎo)致MITF 轉(zhuǎn)錄活性增加；而敲除WIPI1 后，TORC1、GSK3b 激活，TORC2 抑制，從而加速β 連環(huán)蛋白（MITF 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子）的降解，增強MITF 轉(zhuǎn)錄。這些研究表明，WIPI1 通過調(diào)控mTOR 的活性而調(diào)節(jié)MITF 和酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄。

WIPI1 和mTOR 不僅在黑素小體的基因轉(zhuǎn)錄過程中起作用，對黑素小體本身的形成也有重要作用。在WIPI1 基因功能抑制的黑素細(xì)胞中，可見一些類Ⅰ期黑素小體的單層膜囊泡，且自噬相關(guān)基因P62、LC3-Ⅱ也隨之增加，其中P62、LC3-Ⅱ參與Ⅰ期黑素小體形成。同樣，mTOR 抑制后，成熟（Ⅲ、Ⅳ期）黑素體生成增多[5-6]，同時P62 減少而LC3-Ⅱ增加，提示成熟黑素小體不含P62[4]。此外，自噬相關(guān)基因Becn1 功能抑制，黑素及黑素小體的形成減少，但不影響MITF 和酪氨酸酶的轉(zhuǎn)錄，提示Becn1只影響黑素形成而不影響黑素形成關(guān)鍵分子的轉(zhuǎn)錄[4]。

1.1.2 黑素細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白復(fù)合物 關(guān)于黑素細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白復(fù)合物的研究不多，其具體作用機制也尚不明了。Bodemann 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，饑餓條件下，Exo84 復(fù)合物（激發(fā)自噬）和Sec5 復(fù)合物（抑制自噬）將重新分配。誘導(dǎo)慢性抑制mTOR 可顯著加速Exo84 復(fù)合物形成，而快速抑制mTOR 卻不引起Sec5 的分解，說明短暫和緩慢抑制mTOR 對自噬的激發(fā)有不同的作用機制。

在黑素細(xì)胞中，短暫抑制mTOR 活性可加速黑素小體成熟，而饑餓刺激不能有類似作用，表明Exo84 復(fù)合物不參與黑素生成過程，黑素小體的生成可能由Sec5 調(diào)控。

1.1.3 黑素細(xì)胞自噬小體 自噬小體或類自噬小體中間產(chǎn)物在黑素小體形成過程中發(fā)揮作用。敲除黑素細(xì)胞自噬相關(guān)基因ESCRT-Ⅰ將導(dǎo)致來源于內(nèi)涵小體膜的類自噬小體結(jié)構(gòu)中酪氨酸酶相關(guān)蛋白TPR-1 和MART-1 增多[8]，提示類自噬小體結(jié)構(gòu)可能調(diào)節(jié)這些蛋白轉(zhuǎn)運；藥物性抑制自噬小體代謝更新，將抑制色素生成[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，在自噬復(fù)合物循環(huán)障礙的小鼠[10]，以及基因突變導(dǎo)致自噬小體形成障礙的人類疾病如結(jié)節(jié)性硬化癥中[11]，黑素小體的數(shù)量減少，這些研究均支持自噬小體參與黑素小體形成的假說。

1．2 黑素細(xì)胞自噬與黑素降解

自噬除了在黑素生成中有重要作用，其在黑素降解中也同樣發(fā)揮重要作用。

Herman-Pudlak 綜合征1 型（HPS1）是一種常染色體隱形遺傳性疾病，由HPS1 基因突變引起，是一種黑素小體生成障礙性疾病。Smith 等[12]在HPS1 的黑素細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)許多自噬小體，提示自噬可能選擇性清除缺陷性自噬小體。Monobenzone 誘導(dǎo)T 細(xì)胞攻擊黑素細(xì)胞后，導(dǎo)致自噬小體吞噬黑素小體[13]。在人類及嚙齒動物的黑素瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)自噬小體中包含預(yù)成型的黑素小體[14]。這些研究提示，自噬作用可能有助于清除缺陷性黑素小體。

2 黑素細(xì)胞自噬與色素性皮膚病

很早之前就有學(xué)者觀察到黑素細(xì)胞疾病中存在吞噬細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，自噬與色素性疾病存在緊密關(guān)系。

在色素脫失性疾病中，Jeong 等[15]對225 名非節(jié)段性白癜風(fēng)患者（Non-segmental vitiligo，NSV）和439名健康對照組進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）研究，從中選出UVRAG 的5 個SNPs 進(jìn)行分析，其中兩個SNPs（rs1458836, rs7933235）在試驗組和對照組存在基因型差異，這兩個SNPs 位于連鎖不平衡（LD）區(qū)。此外，UVRAG 多態(tài)性的單體型和NSV 密切相關(guān)。他們推測，UVRAG 可能和NSV 易感性相關(guān)。伊藤色素減少癥（Hypomelanosis of Ito）是以渦輪狀色素脫失皮損為特征的遺傳性疾病。Devillers 等[16]對色素脫失區(qū)和其周圍正常膚色區(qū)的細(xì)胞進(jìn)行活檢，通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，黑素細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)許多功能和結(jié)構(gòu)異常的不成熟黑素小體，這些異常的黑素小體在基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞中被自噬小體吞噬。Hermansky-Pudlak 綜合征1 型（HPS1）是一種常染色體隱性遺傳疾病，患者具有皮膚、眼睛和毛發(fā)的色素脫失，研究者通過免疫組化及電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其黑素細(xì)胞膜上有自噬現(xiàn)象[11]。而在藥物性色素脫失疾病中，Monobenzone 誘導(dǎo)T 細(xì)胞攻擊黑素細(xì)胞，導(dǎo)致自噬體吞噬黑素小體[10]。

色素增多性皮膚病中，也可觀察到自噬現(xiàn)象。在20 世紀(jì)80 年代初，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在痣細(xì)胞瘤、單純性黑子的囊泡中吞噬了大量變暗的黑素復(fù)合物——自噬體，同時細(xì)胞呈現(xiàn)出衰老的狀態(tài)[17]。Hirone等[18]人發(fā)現(xiàn)，在單純型雀斑中，電鏡下可在黑素細(xì)胞和角質(zhì)層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)色素大顆粒，這種物質(zhì)由黑素細(xì)胞自噬介導(dǎo)生成。

這些研究表明自噬在色素性皮膚病中發(fā)揮重要作用，自噬對于黑素累積或減少的具體作用機制有待進(jìn)一步闡明。

3 自噬與黑素細(xì)胞腫瘤

自噬與腫瘤之間的關(guān)系是復(fù)雜的，自噬究竟是抑制還是促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展仍尚無定論[19]。自噬在腫瘤中的意義是當(dāng)今國際上研究的熱點，而黑素瘤更是研究的重點之一。很早之前就有學(xué)者通過電鏡觀察到黑素瘤細(xì)胞中存在自噬樣結(jié)構(gòu)。但關(guān)于自噬對黑素瘤的具體作用機制尚不清楚。

Lazova 等[20]對正常皮膚和12 例表皮播散型皮膚黑素瘤組織進(jìn)行了免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)LC3B 抗體在正常的黑素細(xì)胞無染色，在黑素瘤細(xì)胞中，可發(fā)現(xiàn)LC3B 抗體染色陽性。推測黑素瘤細(xì)胞通過自噬獲得營養(yǎng)供應(yīng)而取得生存優(yōu)勢，抑制黑素瘤細(xì)胞自噬，切斷腫瘤細(xì)胞能量來源，可能作為治療黑素瘤的一種有效方法。有學(xué)者用電鏡對12 例接受黑素瘤藥物替莫唑胺（Temozolomide） 和索拉非尼（Sorafenib）治療的Ⅱ期臨床試驗的Ⅳ期黑素瘤患者的組織進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)自噬指數(shù)越高的患者，其生存期和對藥物治療的敏感性越低，提示自噬作用有助于腫瘤的存活；他們還發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的黑素瘤細(xì)胞的小鼠移植瘤實驗中，如果腫瘤細(xì)胞的自噬水平高，則其致瘤性和侵襲性明顯增加。

然而也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，自噬的發(fā)生與黑素瘤的抑癌作用有關(guān)。Miracco 等[21]對149 例黑素細(xì)胞病變（包括痣細(xì)胞痣、發(fā)育不良痣、水平生長階段的黑素瘤、垂直生長階段的黑素瘤及轉(zhuǎn)移性黑素瘤）組織進(jìn)行了免疫組化研究，結(jié)果顯示，良性痣細(xì)胞痣、86．6%的發(fā)育不良痣、54.6%的放射生長階段的黑素瘤、54.3%的垂直生長階段的黑素瘤及26．7%轉(zhuǎn)移性黑素瘤中，beclin1 抗體在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，且在黑素瘤標(biāo)本中，表達(dá)具異質(zhì)性。Beclin1 隨著腫瘤進(jìn)展程度而表達(dá)降低。在53.3%的轉(zhuǎn)移性黑素瘤中，LC3-II 抗體在細(xì)胞質(zhì)中呈低強度表達(dá)，且其表達(dá)強度和病變厚度、潰瘍及細(xì)胞分裂速度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。另外，此研究還在部分有代表性的病例中使用免疫蛋白印跡和mRNA 核酸表達(dá)檢測方法，結(jié)果佐證了免疫組化檢測結(jié)果顯示出的趨勢。

4 展望

黑素代謝機制尚不清楚，且涉及因素繁多。自噬作為其可能的代謝機制之一，研究黑素細(xì)胞自噬及其調(diào)節(jié)的機制，具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。但黑素細(xì)胞自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其對黑素細(xì)胞生存影響的了解還處于起步階段。在今后的研究中,隨著基因技術(shù)、自噬檢測技術(shù)、自噬分子調(diào)節(jié)機制等的不斷深入和完善，對黑素細(xì)胞性疾病的發(fā)病機制研究能有突破性進(jìn)展，為臨床治療提供新的思路和方法。

[1] Yang Z, Klionsky DJ. Eaten alive: a history of macroautophagy[J].Nat Cell Biol,2010,12：814-822.

[2] Raposo G, Marks MS. Melanosomes--dark organelles enlighten endosomal membrane transport[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8:786-797.

[3] Ganesan AK,Ho H,Bodemann B,et al.Genome-wide siRNA-based functional genomics of pigmentation identifies novel genes and pathways that impact melanogenesis in human cells[J].PLoS Genet,2008,4:e1000298.

[4] Ho H,Kapadia R,Al-Tahan S,et al.WIPI1 coordinates melanogenic genetranscriptionandmelanosomeformationviaTORC1inhibition[J].J Biol Chem,2011,8:12509-12523.

[5] Busc觓 R, Bertolotto C, Ortonne JP,et al.Inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase/p70(S6)-kinase pathway induces B16 melanoma cell differentiation[J]. J Biol Chem, 1996, 13: 31824-31830.

[6] Ohguchi K, Banno Y, Nakagawa Y, et al. Negative regulation of melanogenesis by phospholipase D1 through mTOR/p70 S6 kinase 1 signaling in mouse B16 melanoma cells[J]. J Cell Physiol, 2005,205:444-451.

[7] Bodemann BO, Orvedahl A, Cheng T, et al. RalB and the exocyst mediate the cellular starvation response by direct activation of autophagosome assembly[J].Cell,2011,21:253-267.

[8] Truschel ST, Simoes S, Setty SR, et al. ESCRT-I function is required for Tyrp1 transport from early endosomes to the melanosome limiting membrane[J].Traffic,2009,10:1318-1336.

[9] Ni-Komatsu L,Tong C,Chen G,et al.Identification of quinolines that inhibit melanogenesis by altering tyrosinase family trafficking[J].Mol Pharmacol,2008,74:1576-1586.

[10] Chow CY, Zhang Y, Dowling JJ, et al. Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J[J].Nature,2007,5:68-72.

[11] Jimbow K,Fitzpatrick TB,Szabo G,et al.Congenital circumscribed hypomelanosis: a characterization based on electron microscopic study of tuberous sclerosis,nevus depigmentosus,and piebaldism[J].J Invest Dermatol,1975,64:50-62.

[12] Smith JW, Koshoffer A, Morris RE, et al. Membranous complexes characteristic of melanocytes derived from patients with Hermansky-Pudlak syndrome type 1 are macroautophagosomal entities of the lysosomal compartment[J].Pigment Cell Res,2005,18:417-426.

[13] VanDenBoornJG,PicavetDI,VanSwietenPF,etal.Skin-depigmenting agent monobenzone induces potent T-cell autoimmunity toward pigmented cells by tyrosinase haptenation and melanosome autophagy[J].J Invest Dermatol,2011,131:1240-1251.

[14] Bomirski A, Wrzolkowa T, Arendarczyk M, et al. Pathology and ultrastructural characteristics of a hypomelanotic variant of transplantable hamster melanoma with elevated tyrosinase activity[J].J Invest Dermatol,1987,89:469-473.

[15] Jeong TJ, Shin MK, Uhm YK, et al. Association of UVRAG polymorphisms with susceptibility to non-segmental vitiligo in a Korean sample[J].Exp Dermatol,2010,19:e323-e325.

[16] Devillers C,Quatresooz P,Hermanns-Lê T,et al.Hypomelanosis of Ito:pigmentary mosaicism with immature melanosome in keratinocytes[J].IntJ Dermatol,2011,50:1234-1239.

[17] HorikoshiT,Jimbow K,Sugiyama S.Comparison of macromelanosomes and autophagic giant melanosome complexes in nevocellular nevi,lentigo simplex and malignant melanoma[J].J Cutan Pathol,1982,9:329-339.

[18] Hirone T,Eryu Y.Ultrastructure of giant pigment granules in lentigo simplex[J].Acta Derm Venereol,1978,58:223-229.

[19] Eskelinen EL. The dual role of autophagy in cancer[J]. Curr Opin Pharmacol,2011,11:294-300.

[20] Lazova R, Klump V, Pawelek J. Autophagy in cutaneous malignant melanoma[J].J Cutan Pathol,2010,37:256-268.

[21] Miracco C, Cevenini G, Franchi A, et al. Beclin 1 and LC3 autophagic gene expression in cutaneous melanocytie lesions[J].Hum Pathol,2010,41:503-512.