張蓓蓓，蔡 輝

Rho/ROCK信號(hào)通路與間質(zhì)纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

張蓓蓓，蔡 輝

間質(zhì)纖維化是由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積引起的病理改變，是肝硬化、特發(fā)性肺纖維化、高血壓、慢性腎炎、系統(tǒng)性硬化癥等多種疾病致死的主要原因。纖維化組織的重要特征是肌成纖維細(xì)胞(MFB)的出現(xiàn)。Rho/ROCK信號(hào)通路介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架重組在MFB表型分化、收縮、遷移等行為中具有重要意義。阻斷Rho/ROCK信號(hào)通路是治療纖維化相關(guān)疾病的重要目標(biāo)。本文綜述了Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)MFB肌動(dòng)蛋白骨架的調(diào)節(jié)，闡述了其在纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

間質(zhì)纖維化；Rho；Rho激酶；肌成纖維細(xì)胞；肌動(dòng)蛋白骨架

肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)是參與損傷修復(fù)和纖維化的主要細(xì)胞。Rho/Rho激酶(Rho-associated kinase，ROCK)信號(hào)通路介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白骨架重組與MFB表型分化、收縮、遷移等行為關(guān)系密切。本文將對(duì)此進(jìn)行綜述，以期為治療纖維化相關(guān)疾病提供新的思路。

1 Rho/ROCK信號(hào)通路

Rho/ROCK信號(hào)通路廣泛參與生物體內(nèi)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、基因表達(dá)等行為。

Rho包括RhoA、RhoB和RhoC三種異構(gòu)體。Rho分子內(nèi)GTP/ GDP結(jié)合域可以催化GTP水解，使Rho在活性型(GTP結(jié)合型)和失活型(GDP結(jié)合型)構(gòu)象之間循環(huán)。Rho羧基端的共同結(jié)構(gòu)域是翻譯后修復(fù)的位點(diǎn)，其中包括異戊烯基轉(zhuǎn)移酶底物半胱氨酸殘基，只有經(jīng)過修飾的Rho才具有活性。Rho上游信號(hào)因子包括：Eph受體(ephrin receptor)、髓鞘相關(guān)抑制分子(myelin-associated inhibitors)、溶血磷脂酸 (lysophosphatidic acid，LPA)、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine -1- phosphate，S1P)、凝血酶(thrombin)[1]、血栓素A2(thromboxane A2)及其他細(xì)胞因子受體等。Rho下游信號(hào)因子包括ROCK、p140mDia、蛋白激酶N(protein kinase N，PKN)、Rho結(jié)合蛋白(Rhophilin)和 Rho靶蛋白(Rhotekin)等[2]。

ROCK是最早發(fā)現(xiàn)的Rho蛋白效應(yīng)分子，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括高度同源的ROCK1和ROCK2兩個(gè)亞型。ROCK由N端的激酶結(jié)構(gòu)域、中間包含Rho結(jié)合區(qū)域(RBD)的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)及C末端富含半胱氨酸的PH結(jié)構(gòu)域(CRD)構(gòu)成。ROCK的底物包括肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(myosin phosphatase-targeting subunit-1，MYPT1)、肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)、LIM激酶(LIMK)、絲切蛋白(cofilin)、內(nèi)收蛋白(adducin)、ERM家族成員埃茲蛋白(ezrin)/根蛋白(radixin)/膜突蛋白(moesin)及中等纖維(intermediate filaments)成分波形蛋白(vimentin)/結(jié)蛋白(desmin)等。MYPT1/肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)[3]和LIMK/絲切蛋白是研究較為清楚的ROCK下游信號(hào)通路，與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架重組關(guān)系密切。

C3轉(zhuǎn)移酶(C3 transferase) 因具有二磷酸腺苷(ADP)核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，可以催化Rho功能區(qū)域的ADP核糖基化，使Rho失活，阻斷依賴Rho的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。羥甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶是Rho羧基端半胱氨酸殘基異戊烯化修飾的關(guān)鍵酶，他汀類藥物可以抑制此酶的活性，進(jìn)一步抑制ROCK。Y-27632和法舒地爾是非選擇性ROCK抑制劑，作用于三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合區(qū)域，已廣泛應(yīng)用于研究。另外，還有一些ROCK抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，包括Y39983/RKI983、SAR407899、AR12286、K115、INS117548、DE104、BA210和AMA0076等[4]。

2 MFB與纖維化

MFB兼有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的特征，是參與損傷修復(fù)和纖維化的主要細(xì)胞。在超微結(jié)構(gòu)上，包含α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的應(yīng)力纖維和超成熟黏著斑/纖維連接復(fù)合體是MFB最重要的特征。應(yīng)力纖維是胞漿內(nèi)纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-肌動(dòng)蛋白)和肌球蛋白組成的軸向束，是MFB主要的收縮結(jié)構(gòu)。其中，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白是由單體肌動(dòng)蛋白即球狀肌球蛋白(G-肌動(dòng)蛋白)聚合而成。黏著斑為MFB特有的結(jié)構(gòu)，主要由紐蛋白(vinculin)、張力蛋白(tensin)、樁蛋白(paxillin)、ED-A纖維連接蛋白(ED-A fibronectin)等黏著斑相關(guān)蛋白和整合素α、β亞基構(gòu)成，參與MFB的力/化學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)。細(xì)胞內(nèi)的微絲(肌動(dòng)蛋白纖維)通過黏著斑和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中相關(guān)分子(如纖維連接蛋白)結(jié)合，將細(xì)胞錨定于基質(zhì)中，并感應(yīng)細(xì)胞外信號(hào)。MFB具有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，合成膠原的效率較成纖維細(xì)胞顯著增加，還能自分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein -1)、各種基質(zhì)金屬蛋白酶等。

機(jī)體受到炎癥、氧化應(yīng)激和缺血缺氧等刺激引起組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死和ECM結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，多種來源的成纖維細(xì)胞活化，發(fā)生肌動(dòng)蛋白骨架重組分化為MFB，加快組織修復(fù)?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，組織中固有成纖維細(xì)胞(resident fibroblasts)及臨近周細(xì)胞(pericytes)、循環(huán)中骨髓來源的纖維細(xì)胞(fibrocytes)、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都可以分化為MFB[5]。多種細(xì)胞因子、生長因子和ECM成分可以改變肌動(dòng)蛋白骨架，調(diào)節(jié)MFB分化，例如，TGF-β1、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase)能促進(jìn)MFB分化，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor)、Smad7蛋白、脂質(zhì)過氧化體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor -γ)[6]則能抑制MFB分化。研究顯示，MyoD[7]和前列腺素E2(prostaglandin E2)[8]誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向MFB分化可以被逆轉(zhuǎn)，說明MFB并非終末分化細(xì)胞。但MFB是通過凋亡，而不是去分化，消失于瘢痕組織中的[9]。

MFB凋亡是終止修復(fù)反應(yīng)及恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵。皮膚的MFB在肉芽組織向成熟瘢痕進(jìn)展過程中全部凋亡，可不遺留瘢痕，但梗死后的心臟瘢痕中MFB可持續(xù)存在，有的長達(dá)20年。MFB耐受凋亡是發(fā)生纖維化的重要原因。以MFB為靶目標(biāo)的抗纖維化治療包括：阻礙MFB形成和分化；促進(jìn)MFB去分化；誘導(dǎo)MFB凋亡。

3 Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì) MFB的調(diào)節(jié)

成纖維細(xì)胞受到炎癥、損傷等刺激后，ROCK接受Rho傳遞的活化信號(hào)后，發(fā)生絲氨酸/蘇氨酸磷酸化而激活?；罨腞OCK進(jìn)一步磷酸化MLCP上的MLC結(jié)合亞單位，從而使MLCP活性下降，阻礙MLC脫磷酸化，提高成纖維細(xì)胞內(nèi)MLC的磷酸化水平，增加肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的交聯(lián)，促使肌動(dòng)蛋白聚合、重組。肌動(dòng)蛋白骨架重組不僅是MFB分化的重要步驟，也是MFB收縮的重要?jiǎng)恿?。在損傷修復(fù)的早期，MFB收縮可阻止傷口擴(kuò)大，后期則引起瘢痕攣縮。

抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路是治療纖維化相關(guān)疾病的有效方法[10]。Manickam等[11]研究發(fā)現(xiàn)，干擾RhoA表達(dá)和抑制ROCK可以顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的腎MFB內(nèi)Nox4蛋白、α-SMA的表達(dá)和NADPH氧化酶的活性，改善腎纖維化。Lee等[12]報(bào)道，雌二醇通過抑制RhoA/ROCK/絲切蛋白信號(hào)通路，改善卵巢切除大鼠心肌梗死后纖維化，但合用Y-27632并不能增加治療效果。Porter等[13]發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能抑制RhoA和ROCK的活性，阻止培養(yǎng)的人心房肌成纖維細(xì)胞增殖，改善心室重構(gòu)。Gu等[14]報(bào)道，ROCK抑制劑能阻止心臟瓣膜間質(zhì)成纖維細(xì)胞(valvular interstitial cells， VICs)突起(node)形成和α-SMA表達(dá)，可能具有改善心臟瓣膜鈣化的作用。Huang等[15]報(bào)道，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白解聚劑松弛素可使RhoA/ROCK信號(hào)通路失活，肌球蛋白輕鏈磷酸化(MFB收縮性的標(biāo)志)水平下降，對(duì)肺纖維化有治療作用。

3.1 Rho/ROCK上游信號(hào) 以LPA和S1P為例。LPA和S1P同屬溶血磷脂類分子，均能與細(xì)胞膜上的相應(yīng)G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合，激活包括Rho在內(nèi)的下游信號(hào)分子，引起細(xì)胞基因表達(dá)、收縮、遷移等行為。

Tangkijvanich等[16]發(fā)現(xiàn)LPA誘導(dǎo)的肝MFB遷移具有劑量依賴性和飽和性，可以部分被Y-27632和SB-202190(一種p38MAPK抑制劑)所阻斷，故溶血磷脂酸刺激的肝MFB遷移與Rho和p38MAPK有關(guān)。Parizi等[17]認(rèn)為鈣離子介導(dǎo)的MLCK活化，是LPA誘導(dǎo)的MFB收縮的必要條件，而非充分條件，單獨(dú)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高不足以使MFB收縮。而MLCK抑制劑(KT5926和ML-7)、C3-轉(zhuǎn)移酶、Y-27632可以抑制MFB收縮，說明LPA誘導(dǎo)的MFB收縮主要依賴于Rho/ROCK信號(hào)通路。Haak等[18]用LPA誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞作對(duì)照研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，LPA活化Rho，能促進(jìn)結(jié)締組織生長因子、Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)。Gellings 等[19]報(bào)道S1P和鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase，SPHK1，S1P產(chǎn)生的關(guān)鍵酶)依賴S1P2受體和ROCK，以自分泌或旁分泌的方式，提高TGF-β誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)和膠原合成，參與心肌纖維化。Kono等[20]發(fā)現(xiàn)，SPHK1刺激TGF-β1誘導(dǎo)的人和小鼠肺成纖維細(xì)胞向MFB分化也與ROCK有關(guān)。

3.2 Rho/ROCK下游信號(hào) 以心肌素相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(myocardin related transcription factors，MRTFs)/血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)為例。MRTFs家族包括MRTF-A/MAL/ MKL1/BSAC 和MRTF-B/MKL2。MRTFs N端的RPEL區(qū)域與G-肌動(dòng)蛋白的結(jié)合/解離狀態(tài)決定MRTF的活性。靜息狀態(tài)下，G-肌動(dòng)蛋白與內(nèi)輸?shù)鞍爪?β競爭性結(jié)合RPEL，阻止胞質(zhì)MRTF的核轉(zhuǎn)位。Rho活化后，細(xì)胞內(nèi)G-肌動(dòng)蛋白聚合成F-肌動(dòng)蛋白，釋放RPEL區(qū)域，MRTFs進(jìn)入細(xì)胞核，當(dāng)RPEL上的G-肌動(dòng)蛋白全部被移除時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子SRF被激活[18]。SRF在基因水平上調(diào)節(jié)α-SMA表達(dá)[18，21]。

Zhao等[22]建立了一個(gè)能提供穩(wěn)定拉力的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，用于觀察組織預(yù)應(yīng)力對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA的作用。在肌動(dòng)蛋白微絲完整的前提下，施加最大壓力10 min可誘導(dǎo)RhoA 活化，施壓10 min～20 min后發(fā)生肌動(dòng)蛋白微絲聚合。而轉(zhuǎn)染MRTF-A負(fù)性調(diào)節(jié)因子、抑制ROCK或者促使肌動(dòng)蛋白解聚可以完全阻斷應(yīng)力對(duì)α-SMA的表達(dá)。并認(rèn)為應(yīng)力介導(dǎo)的MFB分化與Rho/ ROCK/ LIMK/絲切蛋白途徑有關(guān)。

Huang等[23]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)僵硬也可以活化RhoA/ROCK，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)、MKL1核轉(zhuǎn)位和MFB分化。纖維化組織中，MFB持續(xù)分泌ECM引起的ECM硬度增加是促使纖維化持續(xù)進(jìn)展的重要因素。

Sandbo等[24]用TGF-β誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向MFB分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白聚合劑jasplakinolide能促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞MRTFs的核轉(zhuǎn)位、SRF活化、應(yīng)力纖維形成和α-SMA表達(dá)，而促肌動(dòng)蛋白解聚劑Latrunculin B和Y-27632可以抑制以上過程。故推測(cè)，TGF-β誘導(dǎo)肺MFB分化包括3個(gè)步驟：①Smad依賴的中間信號(hào)分子介導(dǎo)Rho活化和應(yīng)力纖維形成。②肌動(dòng)蛋白聚合引起MKL1核轉(zhuǎn)位和SRF活化。③SRF協(xié)助MKL1表達(dá)，促進(jìn)MFB分化。

Zhou等[25]在肺纖維化模型大鼠和特發(fā)性肺纖維化患者中均觀察到Rho/ROCK信號(hào)通路的活化，肌動(dòng)蛋白骨架的聚合和MKL1的核轉(zhuǎn)位。法舒地爾能下調(diào)BCL-2表達(dá)，激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)MFB凋亡。在肺炎癥損傷后纖維化階段給予法舒地爾或者切除MKL1基因可以預(yù)防實(shí)驗(yàn)大鼠肺纖維化的發(fā)生。

4 小 結(jié)

肺、心臟、肝、腎等器官慢性損傷通過激活Rho/ROCK信號(hào)通路及下游信號(hào)分子，誘導(dǎo)MFB分化、增殖、收縮、遷移等行為，參與損傷修復(fù)，若MFB耐受凋亡并持續(xù)處于激活狀態(tài)則發(fā)生纖維化，晚期可引起器官功能衰竭。目前尚無切實(shí)有效的抗纖維化藥物。Rho/ROCK信號(hào)通路抑制劑對(duì)纖維化疾病顯示了良好的治療效果，有必要進(jìn)一步研究。

[1] Ruiz-Loredo AY，Lopez E，Lopez-Colome AM.Thrombin promotes actin stress fiber formation in RPE through Rho/ROCK-mediated MLC phosphorylation[J].J Cell Physiol，2011，226(2)：414-423.

[2] Shimokawa H，Takeshita A.Rho-kinase is an important therapeutic target in cardiovascular medicine[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(9)：1767-1775.

[3] Aburima A，Wraith KS，Raslan Z，et al.cAMP signaling regulates platelet myosin light chain (MLC) phosphorylation and shape change through targeting the RhoA-Rho kinase-MLC phosphatase signaling pathway[J].Blood，2013，122(20)：3533-3545.

[4] Pan PC，Shen MY，Yu HD，et al.Advances in the development of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitors[J].Drug Discovery Today，2013，18(23/24)：1323-1333.

[5] Hu B，Phan SH.Myofibroblasts[J].Curr Opin Rheumatol，2013，25(1)：71-77.

[6] Kulkarni AA，Thatcher TH，Olsen KC，et al.PPAR-gamma ligands repress TGFbeta-induced myofibroblast differentiation by targeting the PI3K/Akt pathway：implications for therapy of fibrosis[J].PLoS One，2011，6(1)：e15909.

[7] Hecker L，Jagirdar R，Jin T，et al.Reversible differentiation of myofibroblasts by MyoD[J].Exp Cell Res，2011，317(13)：1914-1921.

[8] Kach J，Sandbo N，La J，et al.Antifibrotic effects of noscapine through activation of prostaglandin E2 receptors and protein kinase A[J].J Biol Chem，2014，289(11)：7505-7513.

[9] Ishiguro S，Akasaka Y，Kiguchi H，et al.Basic fibroblast growth factor induces down-regulation of alpha-smooth muscle actin and reduction of myofibroblast areas in open skin wounds[J].Wound Repair Regen，2009，17(4)：617-662.

[10] Tsou PS，Haak AJ，Khanna D，et al.Cellular mechanisms of tissue fibrosis 8 Current and future drug targets in fibrosis：focus on Rho GTPase-regulated gene transcription[J].Am J Physiol Cell Physiol，2014，307(1)：C2-13.

[11] Manickam N，Patel M，Griendling KK，et al.RhoA/Rho kinase mediates TGF-beta1-induced kidney myofibroblast activation through Poldip2/Nox4-derived reactive oxygen species[J].Am J Physiol Renal Physiol，2014，307(2)：F159-171.

[12] Lee TM，Lin SZ，Chang NC.Membrane ERalpha attenuates myocardial fibrosis via RhoA/ROCK-mediated actin remodeling in ovariectomized female infarcted rats[J].J Mol Med(Berl)，2014，92(1)：43-51.

[13] Porter KE，Turner NA，O’Regan DJ，et al.Simvastatin reduces human atrial myofibroblast proliferation independently of cholesterol lowering via inhibition of RhoA[J].Cardiovasc Res，2004，61(4)：745-755.

[14] Gu X，Masters KS.Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300(2)：H448-458.

[15] Huang X，Gai Y，Yang N，et al.Relaxin regulates myofibroblast contractility and protects against lung fibrosis[J].Am J Pathol，2011，179(6)：2751-2765.

[16] Tangkijvanich P，Melton AC，Santiskulvong C，et al.Rho and p38 MAP kinase signaling pathways mediate LPA-stimulated hepatic myofibroblast migration[J].J Biomed Sci，2003，10(3)：352-358.

[17] Parizi M，Howard EW，Tomasek JJ.Regulation of LPA-promoted myofibroblast contraction：role of Rho，myosin light chain kinase，and myosin light chain phosphatase[J].Exp Cell Res，2000，254(2)：210-220.

[18] Haak AJ，Tsou PS，Amin MA，et al.Targeting the myofibroblast genetic switch：inhibitors of myocardin-related transcription factor/serum response factor-regulated gene transcription prevent fibrosis in a murine model of skin injury[J].J Pharmacol Exp Ther，2014，349(3)：480-486.

[19] Gellings Lowe N，Swaney JS，Moreno KM，et al.Sphingosine-1-phosphate and sphingosine kinase are critical for transforming growth factor-beta- stimulated collagen production by cardiac fibroblasts[J].Cardiovasc Res，2009，82(2) ：303-312.

[20] Kono Y，Nishiuma T，Nishimura Y，et al.Sphingosine kinase 1 regulates differentiation of human and mouse lung fibroblasts mediated by TGF-beta1[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37(4)：395-404.

[21] Vartiainen MK，Guettler S，Larijani B，et al.Nuclear actin regulates dynamic subcellular localization and activity of the SRF cofactor MAL[J].Science，2007，316(5832)：1749-1752.

[22] Zhao XH，Laschinger C，Arora P，et al.Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway[J].J Cell Sci，2007，120(10)：1801-1809.

[23] Huang X，Yang N，F(xiàn)iore VF，et al.Matrix stiffness-induced myofibroblast differentiation is mediated by intrinsic mechanotrans- duction[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2012，47(3)：340-348.

[24] Sandbo N，Lau A，Kach J，et al.Delayed stress fiber formation mediates pulmonary myofibroblast differentiation in response to TGF-beta[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，301(5)：L656-666.

[25] Zhou Y，Huang X，Hecker L，et al.Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis[J].J Clin Invest，2013，123(3)：1096-1108.

(本文編輯 郭懷印)

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院(南京210002)

蔡輝，E-mail：njzy_caihui@163.com

R363

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．16．010

1672-1349(2015)16-1844-04

2015-08-18)