■王二柱 朱 群 郭紅偉 常 娟 尹清強(qiáng)

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.駐馬店華中正大有限公司，河南駐馬店 463000）

隨著人們對(duì)畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)重視度不斷的提高，以及抗藥和耐藥型超級(jí)病菌的出現(xiàn)，許多國(guó)家已經(jīng)明文規(guī)定抗生素類(lèi)添加劑的適用動(dòng)物品種、適用階段、劑量、停藥期等，歐盟已于2006年禁止所有抗生素作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用。為了尋找抗生素的替代品，研究人員已開(kāi)發(fā)出了微生態(tài)制劑、酶制劑、寡聚糖、酸化劑、中草藥等產(chǎn)品[1-2]，但在生產(chǎn)實(shí)踐中抗生素的應(yīng)用仍然十分廣泛，為了達(dá)到較好的抑菌和促生產(chǎn)效果，甚至大劑量地使用抗生素，導(dǎo)致抗生素的濫用。為了降低抗生素的使用劑量，將抗生素替代品如微生態(tài)制劑等與抗生素配伍使用，以期獲得良好的抑菌和促生產(chǎn)效果。試驗(yàn)通過(guò)體外試驗(yàn)，研究了金霉素與四種益生菌配伍對(duì)致病性金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用，探討金霉素與微生態(tài)制劑的最佳配伍比例，旨在為金霉素與微生態(tài)制劑同時(shí)應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 金霉素與微生物

金霉素由駐馬店華中正大有限公司提供，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法如下：樣品置于干燥器中干燥12 h后，準(zhǔn)確稱(chēng)取3 g樣品(精確到0.000 2 g)加0.1 mol/l鹽酸30 ml攪拌5 h后定容至50 ml，在無(wú)菌條件下用0.2 μm濾膜過(guò)濾，配制成9 000 U/ml的無(wú)菌金霉素溶液，然后通過(guò)不同梯度的稀釋?zhuān)苽浣鹈顾睾糠謩e為75、150、200、300、400、500、600 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液。益生菌(枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母、乳酪桿菌、糞腸球菌)和金黃色葡萄球菌均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，用蒸餾水定容至1 L，pH值為7.0～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。冷卻后按1%的接種量接種，37℃振蕩（150 r/min）培養(yǎng)48 h。

1.2.2 金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基——抗生素Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基

蛋白胨6 g、葡萄糖1 g、牛肉膏粉1.5 g、酵母浸粉6 g、瓊脂 12～15 g，定容至 1 L，pH 值為 6.5～6.6，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)乳酪桿菌的MRS培養(yǎng)基

胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 ml、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉2 g、硫酸鎂200 mg、硫酸錳50 mg，用蒸餾水定容至1 L，pH值為6.2～6.6，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種乳酸桿菌后，37℃靜止培養(yǎng)48 h。

1.2.4 培養(yǎng)酵母菌的YPD培養(yǎng)基

酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、用蒸餾水定容至1 L，pH值為7.0～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種酵母菌后，30℃振蕩（150 r/min）培養(yǎng)48 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合益生菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

采用四因素四水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，先將單獨(dú)益生菌培養(yǎng)液用培養(yǎng)基稀釋至活菌數(shù)為1×108個(gè)/ml，然后按表1的體積比配制成復(fù)合益生菌制劑。將金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液均勻地涂布在已加入抗生素Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基的雙碟培養(yǎng)皿中，待其完全吸收后，放入牛津杯，向牛津杯中加入100 μl復(fù)合益生菌菌液，放于4℃吸收4 h，然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果

由上一步試驗(yàn)選出的復(fù)合益生菌最優(yōu)組合，與一定量的金霉素混合，配制成含不同金霉素濃度的復(fù)合益生菌制劑。另外，以不同濃度的單一金霉素作為對(duì)照組，按1.3.1的試驗(yàn)方法測(cè)定抑菌圈直徑。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，采用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用(見(jiàn)表1)

表1 復(fù)合益生菌組合對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

由表1可知，枯草芽孢桿菌的最大k值為k4，酵母菌的最大k值為k1，乳酪桿菌的最大k值為k4，糞腸球菌的最大k值為k1，這表明復(fù)合益生菌抑制金黃色葡萄球菌的最佳配比為：枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌=4∶1∶4∶1（P＜0.05）。其R值的大小依次為：RC＞RA＞RD＞RB，即乳酪桿菌＞枯草芽孢桿菌＞糞腸球菌＞酵母菌,這表明復(fù)合益生菌中乳酪桿菌所占比例的變化對(duì)抑制金黃色葡萄球菌的影響最大，其次分別是枯草芽孢桿菌、酵母菌和糞腸球菌。

2.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用(見(jiàn)表2)

表2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

由表2可知，隨著金霉素濃度的提高，無(wú)論是單一金霉素還是金霉素與復(fù)合益生菌的配伍，其抑菌效果均表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。單獨(dú)復(fù)合益生菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用與200～300 mg/kg的金霉素抑制作用相當(dāng)。當(dāng)150 mg/kg金霉素與復(fù)合益生菌配合后，其抑菌效果與單獨(dú)400～500 mg/kg金霉素作用相當(dāng)；而當(dāng)200～300 mg/kg金霉素與復(fù)合益生菌配合后，其抑菌效果要優(yōu)于單獨(dú)600 mg/kg金霉素的作用。即低濃度金霉素與復(fù)合益生菌配合后，可以達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果。

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)

益生菌是一種活菌制劑，當(dāng)其數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)，對(duì)宿主的健康有促進(jìn)作用[3]。目前，益生菌作為一種新型添加劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和動(dòng)物生產(chǎn)中[4-5]，它可以調(diào)整動(dòng)物腸道的微生物菌群平衡，并產(chǎn)生一些抗菌性物質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)[6]。以往的研究表明，益生菌的抑菌活力在體外可通過(guò)牛津杯法進(jìn)行測(cè)定[7]，牛津杯中的抗菌物質(zhì)可以透過(guò)瓊脂來(lái)抑制表面病原菌的生長(zhǎng)，抑菌圈越大，其抑菌活力越高。

本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究枯草芽孢桿菌、酵母菌、乳酪桿菌和糞腸球菌抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，結(jié)果表明，乳酪桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最大，其主要原因是乳酪桿菌能夠分泌乳酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)[8]。本研究得出的益生菌最佳配比為：枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌=4∶1∶4∶1，其抑菌能力可以達(dá)到200～300 mg/kg金霉素的抑菌作用，為抗生素的替代提供了參考。

3.2 復(fù)合益生菌與金霉素配伍抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)

金霉素是一種廣譜抗菌劑，無(wú)論對(duì)致病菌還是有益菌都有一定程度的抑制作用。本研究結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合益生菌與75 mg/kg金霉素配伍后，其抑菌圈直徑與單獨(dú)復(fù)合益生菌相似。隨著金霉素配伍劑量的增大，抑菌圈直徑表現(xiàn)出逐漸增大的趨勢(shì)，且大于對(duì)應(yīng)劑量的單獨(dú)金霉素的抑菌能力，表明復(fù)合益生菌與金霉素配伍使用具有疊加抑菌效應(yīng)。白耀輝等(2011)[9]研究表明，將益生菌制劑與抗生素聯(lián)合應(yīng)用在規(guī)?；怆u生產(chǎn)中可以顯著提高肉仔雞的日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，改善胴體品質(zhì)，這表明益生菌與抗生素配伍使用是可行的，與本研究的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究獲得了四種益生菌抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的最佳配伍比例為：枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌=4∶1∶4∶1，該復(fù)合益生菌的抑菌能力與200～300 mg/kg金霉素的抑菌能力相當(dāng)。當(dāng)150 mg/kg金霉素與益生菌配合后，其抑菌能力與單獨(dú)400～500 mg/kg金霉素抑菌能力相當(dāng)，即低濃度金霉素與復(fù)合益生菌配合后，可以達(dá)到高濃度金霉素的抑菌效果，因此可減少實(shí)際生產(chǎn)中抗生素的用量。