miR-208和miR-499與心血管病研究進(jìn)展

陳耽李驪華

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管科，重慶400016)

關(guān)鍵詞〔〕miR-208；miR-499；心血管病

中圖分類號(hào)〔〕R54〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助(No.財(cái)社〔2011〕170號(hào))

通訊作者：李驪華(1970-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事冠心病動(dòng)脈粥樣硬化研究。

第一作者：陳耽(1990-)，男，在讀碩士，主要從事冠心病缺血心肌保護(hù)研究。

microRNA(miRNA)是一類由20~25個(gè)核苷酸組成的在進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA。主要通過與靶mRNA的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)的特異性序列堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后抑制，從而調(diào)控基因的表達(dá)〔1〕。miRNA在高等生物生命活動(dòng)中扮演重要角色，參與生物細(xì)胞增殖、分化、免疫、應(yīng)激、凋亡、癌變等多種生命過程，并在腫瘤發(fā)生及心血管病等各種疾病中起到至關(guān)重要的作用。

1miR-208、miR-499與MyomiRs家族

MyomiRs家族即肌球蛋白基因內(nèi)含子編碼的miRNA家族，包括miR-208a、miR-208b、miR-499，其編碼基因分別位于(Myh)6/a組織相容性復(fù)合體(MHC)、Myh7/βMHC、Myh7b的內(nèi)含子內(nèi)。并反過來調(diào)節(jié)肌球蛋白基因表達(dá)和肌肉對(duì)生理病理信號(hào)的反應(yīng)〔2〕。在生長(zhǎng)發(fā)育不同階段其表達(dá)不同，β-MHC/miR-208b在胎兒小鼠心臟高表達(dá)，而隨著小鼠發(fā)育表達(dá)下降，成年小鼠幾乎不表達(dá)；而a-MHC/miR-208b正好相反，在胎兒小鼠幾乎不表達(dá)，隨著小鼠發(fā)育表達(dá)增加，成年小鼠達(dá)高峰；myh7b/miR-499則一直保持較高水平。且miR-208a具有心臟特異性，幾乎只在心臟表達(dá)，而miR-208b和miR-499在心臟和骨骼肌均有表達(dá)〔3〕。人類myh6和myh7基因串聯(lián)在染色體14 q12上，miR-208a和miR-208b具有大量相同的重復(fù)序列，且miR-208在物種間具有高度保守性。

miR-208a對(duì)β-MHC/miR-208b和myh7b/miR-499的表達(dá)具有上游調(diào)控作用，miR-208不僅調(diào)控在應(yīng)激和甲狀腺功能減退時(shí)β-MHC/miR-208b的表達(dá)，也調(diào)控myh7b/miR-499在成人心臟的表達(dá)。在miR-208a-/+成年小鼠心臟myh7b和miR-499的表達(dá)下降50%；而在miR-208a-/-成年小鼠心臟myh7b和miR-499幾乎不表達(dá)。此外，在miR-208a-/-小鼠心臟強(qiáng)制表達(dá)miR-499時(shí)足以激活β-MHC/miR-208b 的表達(dá)及抑制快肌基因的異位表達(dá)，這表明miR-499是miR-208a發(fā)揮作用的一個(gè)下游效應(yīng)介質(zhì)〔2〕。肌球蛋白基因不僅編碼主要的肌肉收縮蛋白，同時(shí)通過內(nèi)含子中MyomiRs家族的miRNA網(wǎng)絡(luò)控制肌肉的基因表達(dá)和性能，在心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要的作用。

2miR-208a

人類miR-208a的編碼基因位于第14號(hào)染色體上的a-MHC基因的第27個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。

2.1miRNA-208a與心肌肥厚van Rooij等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)miR-208是心肌肥厚、纖維化的重要調(diào)控因子。在應(yīng)激和甲狀腺功能減退的情況下miR-208通過與甲狀腺素受體相關(guān)蛋白(Thrap1)靶基因的3′-UTR結(jié)合，轉(zhuǎn)錄后抑制Thrap1表達(dá)，從而使β-MHC表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)心肌肥厚和心肌纖維化。此外，Montgomery等〔4〕還推斷miR-208通過調(diào)節(jié)多種β-MHC轉(zhuǎn)錄抑制因子如Sox 6、Purβ、Sp3和 HP1β的表達(dá)，使β-MHC上調(diào)。

Callis等〔5，6〕發(fā)現(xiàn)，miR-208實(shí)際上是肌球蛋白miRNA家族中的一員，分miR-208a和miR-208b兩個(gè)亞型。在心臟超表達(dá)會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞(CMs)增生性生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)除Thrap1 外，miR-208a還以肌肉生長(zhǎng)抑制素基因(myostatin)為靶標(biāo)，負(fù)性調(diào)節(jié)心肌的生長(zhǎng)和肥大。Montgomery等〔7〕也發(fā)現(xiàn)miR-208a通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，調(diào)控應(yīng)激刺激下的心臟基因表達(dá)。Thrap1是miR-208a的主要靶標(biāo)。通過給予miR-208a抑制劑使miR-208a減少，Thrap1表達(dá)上調(diào)，通過阻斷下游的應(yīng)激應(yīng)答基因的激活而使β-MHC表達(dá)下調(diào)，延緩高血壓大鼠心功能障礙的進(jìn)程。表明miR-208a在病理性心臟重塑中起重要作用。

2.2miRNA-208a與心臟傳導(dǎo)Callis等〔5〕研究顯示，miR-208a過表達(dá)容易引起的心律失常，在miR-208a基因敲除小鼠的心電圖中，約80%的QRS波前p波消失，表明miR-208a基因敲除小鼠容易發(fā)生心房顫動(dòng)。連接蛋白(Cx)40缺乏易導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)缺陷，Cx 40的表達(dá)僅限于心房和構(gòu)成希氏束、浦肯野纖維的心肌細(xì)胞〔8〕。與野生型相比miR-208a-/-小鼠 Cx 40的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，表明Cx 40的表達(dá)需要miR-208a參與。除了調(diào)節(jié)Cx 40的表達(dá)，miR-208a還可以直接抑制轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Hop在成人心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的表達(dá)〔5〕，在miR-208a-/-小鼠心臟GATA4表達(dá)上調(diào)而Hop表達(dá)下調(diào)，表明GATA4可能是miR-208a的直接靶標(biāo)之一，而Hop通路間接受miR-208a調(diào)控。并發(fā)現(xiàn)與野生型相比miR-208a-/-小鼠Hop通路的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均降低。同時(shí)有數(shù)據(jù)表明〔9〕，Hop直接作為Nkx2.5下游效應(yīng)元件發(fā)揮功能，通過同源重組使Hop失活可導(dǎo)致心肌發(fā)育嚴(yán)重缺陷而使部分胚胎致死。

2.3miRNA-208a與代謝Zhang等〔10〕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度胰島素使得血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中miR-208上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn) VSMC 異常增殖，而抑制miR-208 表達(dá)將阻斷胰島素促 VSMC 增殖的作用。而后通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)等方法發(fā)現(xiàn) miR-208可作用于下游靶蛋白 p21，對(duì)p21發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控作用，抑制 p21 表達(dá)，提示高濃度胰島素可通過增加miR-208的表達(dá)，間接抑制 p21 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn) VSMC 增殖。

Grueter等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)心臟通過中介因子復(fù)合體的亞基中介因子復(fù)合體亞基(MED)13控制甲狀腺激素和其他核激素受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)全身能量平衡。MED13又受心臟特異性miRNA，miR-208a的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。心肌特異性超表達(dá)MED13或通過藥物下調(diào)miR-208a可使小鼠抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和改善全身胰島素敏感性和葡萄糖耐受性。相反，CMs MED13基因缺失將導(dǎo)致高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖增強(qiáng)并使代謝綜合征加劇。MED13通過增加能源消耗和調(diào)控許多基因參與心臟的能量平衡而產(chǎn)生代謝活動(dòng)。這些研究結(jié)果揭示了心臟在控制全身代謝方面的作用并提示MED13和miR-208a可作為治療代謝紊亂的潛在靶點(diǎn)。

3miR-499

人類miR-499的編碼基因位于第20號(hào)染色體上的Myh7b基因的第20個(gè)內(nèi)含子內(nèi)。miR-499一般與Myh7b協(xié)同表達(dá)，主要表達(dá)于心肌及骨骼肌慢肌纖維，其他組織亦有少量表達(dá)。研究〔12~18〕發(fā)現(xiàn)miR-499在心臟發(fā)育、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷，心肌肥厚及心力衰竭等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。

3.1miR-499與CMs增殖及分化miR-499在心臟的發(fā)育分化過程中及正常生理情況下大量表達(dá)。Wilson等〔12〕通過微陣列法分析H7人類胚胎干細(xì)胞(hESC)源性心肌細(xì)胞(hESC-CMs)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-499使胚體心臟轉(zhuǎn)錄因子肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(MEF)2C顯著上調(diào)，而MEF2C是心臟收縮基因激活和心臟結(jié)構(gòu)形成的重要轉(zhuǎn)錄因子，表明miR-499可能是人類胚胎干細(xì)胞特異性分化的重要因子。

Sluijter等〔13〕在體外分離培養(yǎng)胎兒心肌祖細(xì)胞(CMCPs)向CMs分化過程中，檢測(cè)到肌肉特異性miR-499顯著上調(diào)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-499后發(fā)現(xiàn)CMCP的增殖率下降了15%，但增強(qiáng)了CMCP和hESC向成熟心肌細(xì)胞的定向分化。顯示miR-499可通過抑制Sox 6，使Sox 6蛋白含量減少和小干擾核糖核酸(siRNA)介導(dǎo)的Sox 6沉默，強(qiáng)烈誘導(dǎo)CMCPs肌源性分化。

Zhang等〔14〕通過構(gòu)建miR-499慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miR-499增加心臟的特定基因Nkx2.5、GATA4、MEF2C、心肌肌鈣蛋白(cTnI)的表達(dá)，降低β-catenin的磷酸化/去磷酸比率進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向CMs分化。

Hosoda等〔15〕發(fā)現(xiàn)miR-499也影響人心肌干細(xì)胞(hCSCs)向成熟CMs的分化。miR-499在hCSCs幾乎檢測(cè)不到，但在有絲分裂后的CMs中高水平表達(dá)。miR-499可穿過細(xì)胞間隙連接通道，并進(jìn)入到鄰近的hCSCs細(xì)胞內(nèi)，通過siRNA抑制Sox 6和rod1靶基因的合成而發(fā)揮功能使GATA4和Nkx2.5表達(dá)增加進(jìn)而促進(jìn)hCSC分化。此外miR-499不僅影響胚胎期CMs分化，在心肌損傷后細(xì)胞修復(fù)過程中也起著重要作用。體外培養(yǎng)高表達(dá)miR-499的hCSCs并注入到動(dòng)物心肌梗死邊緣區(qū)，發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)CMs再生及化分明顯增加，且心功能明顯改善。

3.2miR-499與CMs凋亡心臟的功能是高度依賴于ATP的產(chǎn)生，所以CMs富含大量線粒體，以提供心肌所需的能量。線粒體不斷進(jìn)行融合和裂變以維持細(xì)胞器活性。但異常線粒體裂變會(huì)參與細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)，引起心肌梗死中細(xì)胞凋亡。線粒體核裂變需要?jiǎng)恿ο嚓P(guān)蛋白(DRP)1的參與，使線粒體外膜分裂，從而使線粒體管裂變成片段〔16〕。Wang等〔17〕發(fā)現(xiàn)在心肌缺血等病理?xiàng)l件下miR-499水平明顯下調(diào)，考慮miR-499可能參與調(diào)節(jié)CMs凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)磷酸酶催化亞基(CnA)a 和CnAβ蛋白是miR-499的直接靶標(biāo)，miR-499通過抑制鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)CRP1脫磷酸化，減少CRP1在線粒體累積和CRP1介導(dǎo)的線粒體裂變程序激活進(jìn)而抑制CMs凋亡。

還通過分析miR-499的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)2個(gè)典型的P53的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，P53基因可與這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)miR-499的表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)miR-499轉(zhuǎn)基因小鼠心臟重塑和心功能明顯改善，如心臟/體重比值，CMs橫截面積，膠原含量明顯下降。而通過antagomir沉默小鼠 miR-499表達(dá)加重有害心臟重塑和缺血再灌注損傷，并伴有膠原沉積增加和心肌肥厚、心室擴(kuò)大及明顯心功能不全。

3.3miR-499與心臟應(yīng)答Shieh等〔18〕利用轉(zhuǎn)基因表達(dá)不同水平miR-499小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-499高水平表達(dá)可以劑量依賴的方式導(dǎo)致心肌肥厚和心肌病。高水平miR-499可顯著下調(diào)心臟早期應(yīng)答基因(Egr)1，Egr2和(Fos)的表達(dá)，增加壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心功能障礙的易感性，致小鼠發(fā)生自發(fā)性心臟收縮功能障礙。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-208a基因敲除小鼠miR-499水平下降而Egr1，Egr2 和 Fos水平升高，提示miR-208和miR-499可能共同參與心臟早期應(yīng)答基因的調(diào)控。而早應(yīng)答基因在心臟對(duì)壓力負(fù)荷應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄層面占重要地位，提示調(diào)控miRNA可能是影響高血壓或主動(dòng)脈瓣疾病等壓力超負(fù)荷過大誘發(fā)的心血管疾病進(jìn)展的重要因素。而在Ikeda等〔19〕研究中在人主動(dòng)脈瓣狹窄時(shí)，miR-499水平明顯下降。這種減量調(diào)節(jié)心臟基因表達(dá)的變化可能是一種心臟對(duì)壓力負(fù)荷重要的生理應(yīng)答。也可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因小鼠非正常的miR-499下調(diào)擾亂了心臟對(duì)壓力負(fù)荷的正常應(yīng)答。

4miR-208，miR-499與生物學(xué)標(biāo)志物

Mitchell等〔20〕首次提出miRNA在人類血漿中穩(wěn)定存在并保有內(nèi)源性RNA酶活性。使miRNA作為生物學(xué)標(biāo)志物成為可能。

Ji 等〔21〕在用異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死模型中發(fā)現(xiàn)血漿miR-208的濃度明顯增加，其出現(xiàn)的時(shí)間窗幾乎與肌鈣蛋白一致。而后Corsten 等〔22〕對(duì)急性心肌梗死(AMI)、病毒性心肌炎、心舒張功能不全及急性心力衰竭4種心臟病患者的血漿miRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，AMI患者血漿miR-208b 和miR-499 顯著升高，分別上升1 600倍和100倍，并與肌鈣蛋白T 和肌酸磷酸激酶(CPK)的升高顯著相關(guān)；而在病毒性心肌炎患者中則分別升高30倍和6倍。提示心肌受損時(shí)miR-208b 和miR-499釋放入血增加。Wang等〔23〕在對(duì)66例胸痛患者及大鼠心肌梗死模型的研究中發(fā)現(xiàn)AMI患者血漿miR-1、-133a、-499和miR-208a水平顯著高于健康志愿者、非AMI患者及其他心血管疾病患者。且發(fā)現(xiàn)miR-208a具有心肌特異性，幾乎只在心臟表達(dá)。在90.9% 的AMI患者和100% 的癥狀發(fā)生4 h內(nèi)的AMI患者血漿中均檢測(cè)出miR-208a表達(dá)，而非AMI幾乎檢測(cè)不到檢測(cè)不到miR-208a表達(dá)。且通過對(duì)特征曲線分析提示miR-208a對(duì)AMI診斷具有較高的靈敏性及特異性。

Adachi等〔24〕通過miRNA陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-499也具有心肌特異性，且miR-499在AMI患者血漿表達(dá)顯著增加，而其他心臟疾病患者和健康受試者則處于較低水平，表明miR-499可能是AMI的生物標(biāo)志物。

另外少數(shù)臨床結(jié)果顯示〔25〕，在擴(kuò)張型心肌病的心肌miR-208水平升高，提示miR-208可以預(yù)測(cè)擴(kuò)張型心肌病患者心力衰竭和心臟猝死事件的發(fā)生，可能與人類的擴(kuò)張型心肌病中胚胎模式基因的重新表達(dá)(例如，上調(diào)β-MHC)和心肌膠原積累的增加導(dǎo)致不可逆的心肌損傷有關(guān)。

綜上，miR-208和miR-499同屬于MyomiRs家族，在心臟發(fā)育、心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚、心臟電生理傳導(dǎo)、心力衰竭及機(jī)體代謝等病理生理過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也是很好的生物標(biāo)志物。而隨著各種miRNA類似物及antagomirs和agomirs的研發(fā)，使miRNA的人為調(diào)控成為一種新的治療手段。通過調(diào)控miR-208和miR-499表達(dá)，減少心肌肥厚和心肌纖維化并抑制CMs凋亡，同時(shí)促進(jìn)CMs再生和定向分化，也許會(huì)為AMI患者提供一種新的治療策略。但是，目前大部分研究仍處于初期階段，甚至部分結(jié)論只是推斷，miR-208和miR-499是否還有其他靶標(biāo)，部分精細(xì)調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)miR-208a對(duì)miR-208b和miR-499具有上游調(diào)控作用，而miR-499又是miR-208a發(fā)揮作用的重要下游效應(yīng)介質(zhì)以及其所具有的大量相同的重復(fù)序列，它們是否還存在更復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還有待探索。

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〔2013-12-27修回〕

(編輯趙慧玲/杜娟)