陳清嬋，簡(jiǎn)清梅*，王勁松，孫愛(ài)紅，李蓉

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

從自然發(fā)酵小麥醬中篩選曲霉及制曲工藝研究

陳清嬋，簡(jiǎn)清梅*，王勁松，孫愛(ài)紅，李蓉

（荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院，湖北荊門448000）

從自然發(fā)酵的小麥醬中分離得到4株黃曲霉（Aspergillus flavus）和2株黑曲霉（Aspergillus niger），對(duì)其進(jìn)行生理效價(jià)分析，結(jié)果表明，黃曲霉4號(hào)產(chǎn)糖化型淀粉酶和蛋白酶能力最強(qiáng)，且具有較強(qiáng)的產(chǎn)α-淀粉酶和酯化酶的能力，適合作為小麥醬制曲的發(fā)酵菌株。對(duì)其制曲工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在接種量為4%，制曲溫度為32℃，制曲時(shí)間為70 h的條件下，小麥曲的蛋白酶酶活力為549 U/g，較自然發(fā)酵制曲的481 U/g有較大提高。

小麥醬；曲霉菌種；制曲

小麥醬作為我國(guó)廣大農(nóng)村一種傳統(tǒng)的調(diào)味品，是以小麥為主要原料生產(chǎn)的醬類，一直以來(lái)由傳統(tǒng)家庭式自然發(fā)酵方法生產(chǎn)，成品香氣濃郁，風(fēng)味俱佳，可代替醬油使用，且具有一定的保健功能，深受人們喜愛(ài)[1]。現(xiàn)今，市面上銷售醬制品主要以面醬[2-3]、黃豆醬[4]、豆瓣醬[5]、豆豉[6]為主，且對(duì)這些醬品的菌相分析和加工工藝都已進(jìn)行過(guò)廣泛研究。而小麥醬在市面少見(jiàn)，且相關(guān)研究較少。對(duì)小麥醬實(shí)行規(guī)?；a(chǎn)，具備良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。

發(fā)酵劑的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品色澤、風(fēng)味、口感等品質(zhì)的影響尤其重要，故優(yōu)良的醬類發(fā)酵劑應(yīng)該來(lái)自于自然發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)醬產(chǎn)品[7]。對(duì)于小麥醬而言亦是如此，較優(yōu)良的發(fā)酵劑菌種對(duì)于研究小麥醬發(fā)酵劑非常重要。傳統(tǒng)發(fā)酵小麥醬色澤鮮亮，口感極佳，這同參與其中的各種微生物發(fā)酵作用是緊密相關(guān)的。

醬制品的釀造過(guò)程可分為兩個(gè)主要的階段：制曲階段和高鹽發(fā)酵階段。在制曲階段起作用的主要是霉菌，其功能是產(chǎn)酶（淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等）。由于各個(gè)地方氣候條件的差異，空氣中的微生物組成也各不相同，因此各地發(fā)酵產(chǎn)生的醬制品風(fēng)味各異。醬類制品的工業(yè)化生產(chǎn)制曲所用菌種多為米曲霉，也有用黑曲霉和混合菌種制曲的。米曲霉中用得最多的是滬釀3.042[8]，也有些使用自己從自然界分離的菌種，如米曲霉Y29[9]、QU3601[10]等。本實(shí)驗(yàn)以湖北荊門地區(qū)仙居小麥醬為研究對(duì)象，從小麥醬的傳統(tǒng)發(fā)酵曲中分離與小麥醬色、香、味有關(guān)的霉菌種類，篩選優(yōu)良菌種，以及研究小麥醬人工接種制曲發(fā)酵的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)自然條件下制作的小麥曲：取自湖北荊門仙居小麥醬；小麥、土豆：市售；蔗糖（分析純）、瓊脂（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來(lái)水1 000 mL；自然pH；種曲培養(yǎng)基：麩皮8 g，面粉2 g，水10 g，于121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150-S電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；BYY-200B恒溫?fù)u床：常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；YQL-100SII立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1901紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；JJ-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州金凈科技有限公司；90-2型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；E-201-C型PH復(fù)合電極：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的酶活力檢測(cè)方法

將分離得到的霉菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板培養(yǎng)基中，挑取單菌落重新接種至新鮮培養(yǎng)基斜面，重復(fù)3次達(dá)到活化。根據(jù)霉菌孢子濃度作適當(dāng)?shù)南♂?，最后保持相同的孢子濃度接種到種曲培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)40 h后取樣檢測(cè)結(jié)果。

取5 g樣品，置于250 mL三角瓶中，加入50 mL生理鹽水，30℃、150 r/min恒溫?fù)u床振搖30 min，用4層紗布過(guò)濾獲得酶液，供測(cè)定用。

α-淀粉酶（液化型淀粉酶）的檢測(cè)：GB 8275—2009《食品添加劑α-淀粉酶制劑》[11]；糖化型淀粉酶的檢測(cè)：GB 8276—2006《食品添加劑糖化酶制劑》[12]；蛋白酶的檢測(cè)：GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[13]。

酯化酶活力的測(cè)定[14]：取10 mL環(huán)己烷、3.65 mL乙醇、6.25 mL己酸（所有試劑每500 mL加入30 g無(wú)水硫酸鈉）及0.2 mL酶液，酯化反應(yīng)在密閉的100 mL錐形瓶中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為36℃，24 h后，取上清液0.5 mL于50 mL錐形瓶中，加入5 mL水，2滴酚酞，滴定至終點(diǎn)，測(cè)定己酸消耗量。

酶活力單位定義：在測(cè)定條件下每分鐘消耗1 μmol己酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位，U。

1.3.2 黃曲霉素的測(cè)定

GB/T5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定》[15]。1.3.3小麥醬制曲工藝參數(shù)確定

（1）接種量：將蒸熟的小麥分別接種3%、4%、5%、6%、7%曲霉，在30℃溫度條件下發(fā)酵48 h進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)測(cè)定曲霉蛋白酶活力確定最佳接種量。

（2）制曲溫度：將蒸熟的小麥接種3%曲霉，分別設(shè)定制醅溫度為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發(fā)酵48 h進(jìn)行試驗(yàn)，以曲霉蛋白酶活力為主要指標(biāo)，確定最佳制曲溫度。

（3）制曲時(shí)間：將蒸熟的小麥接種3%曲霉，在30℃溫度條件下，分別發(fā)酵46 h、54 h、62 h、70 h、78 h進(jìn)行試驗(yàn)，以曲霉蛋白酶活力為主要指標(biāo)，確定最佳制曲時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)霉菌菌株的鑒定[16-17]

從小麥醬曲中挑取其中的優(yōu)勢(shì)菌株純化后轉(zhuǎn)至斜面保存以備鑒定之用。經(jīng)過(guò)對(duì)霉菌的分離純化，最后在傳統(tǒng)樣中分離得到6株菌，根據(jù)菌落形態(tài)和顯微鏡下分生孢子頭形態(tài)觀察，得到1～4號(hào)菌菌落初帶黃色，然后變成黃綠色，老后顏色變暗，反面無(wú)色。低倍顯微鏡下觀察可見(jiàn)分生孢子頭呈疏松放射狀，有時(shí)形成不明顯的柱狀，分生孢子頭呈黃-綠色至深橄欖-褐，分生孢子梗粗糙無(wú)色，初步判斷屬于黃曲霉群。以下分別標(biāo)號(hào)黃1、黃2、黃3、黃4；5～6號(hào)菌菌絲初為白色，厚絨狀；菌落表面黑色，反面無(wú)色。分生孢子頭幼時(shí)球形，后變成放射形，初步判斷為曲霉科，屬于黑曲霉群。以下分別標(biāo)號(hào)黑1、黑2。

2.2 霉菌酶活力檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 霉菌產(chǎn)淀粉酶能力的比較

6種不同霉菌產(chǎn)液化型淀粉酶（α-淀粉酶）和糖化型淀粉酶能力如圖1所示。

由圖1可見(jiàn)，黑1號(hào)曲霉產(chǎn)α-淀粉酶能力最高，黑2號(hào)和黃4號(hào)曲霉產(chǎn)α-淀粉酶能力也較強(qiáng)。黃4號(hào)曲霉產(chǎn)糖化型淀粉酶能力最強(qiáng)，其他菌種均較弱。

2.2.2 霉菌產(chǎn)蛋白酶能力的比較

不同霉菌產(chǎn)中性蛋白酶能力結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見(jiàn)，黃1、黃4和黑1號(hào)菌株產(chǎn)中性蛋白酶能力都較強(qiáng)，其中黃4號(hào)產(chǎn)蛋白酶的能力最強(qiáng)。

2.2.3 霉菌產(chǎn)酯化酶能力的比較

不同霉菌產(chǎn)酯化酶能力結(jié)果如圖3所示。

由圖3可見(jiàn)，黑1號(hào)曲霉產(chǎn)酯化酶的能力最強(qiáng)，其次是黃1和黃4號(hào)菌株。

綜合以上數(shù)據(jù)，黃4號(hào)曲霉其各項(xiàng)產(chǎn)酶能力都較高，可以作為人工單菌種發(fā)酵制小麥曲菌種。對(duì)其進(jìn)行黃曲霉素檢測(cè)，結(jié)果表明其不產(chǎn)黃曲霉毒素，可以用于生產(chǎn)制曲。

2.3 制曲工藝的確定

將篩選出的黃4號(hào)曲霉作為小麥醬發(fā)酵菌種，通過(guò)研究其在不同接種量、時(shí)間和發(fā)酵溫度條件下所產(chǎn)生的蛋白酶活力變化，確定其制曲工藝參數(shù)。

2.3.1 接種量的影響

接種量對(duì)小麥曲蛋白酶酶活的影響結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，接種量為4%時(shí)，麥曲里蛋白酶酶活達(dá)到最大，之后隨著接種量的增加蛋白酶酶活反而減少，接種量在5%和6%時(shí)，蛋白酶活力變化平緩，可在7%的接種量時(shí)蛋白酶活力迅速減小。這可能是曲霉接種量過(guò)多不宜于菌種之間的生長(zhǎng)，接種量太大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，不足以維持曲霉的生長(zhǎng)所需，將形成大量的休眠孢子，降低酶的活性。曲霉接種量太少的話，繁殖量達(dá)不到要求，會(huì)造成營(yíng)養(yǎng)浪費(fèi)。因此，確定小麥醬制曲的最佳接種量為4%。

2.3.2 制曲溫度的影響

制曲溫度對(duì)小麥曲蛋白酶酶活的影響結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，適宜的溫度有利于微生物的繁殖，產(chǎn)生較高的蛋白酶酶活。隨著制曲溫度上升，小麥曲的蛋白酶活逐漸升高，在32℃時(shí)達(dá)到峰值，這與曲霉最適生長(zhǎng)溫度在30℃左右的結(jié)果是相符合的。溫度過(guò)高過(guò)低都不利于微生物的生長(zhǎng)。因此確定純種發(fā)酵麥醬制曲最佳溫度為32℃。

2.3.3 制曲時(shí)間的影響

制曲時(shí)間對(duì)小麥曲蛋白酶酶活的影響結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，接種后的小麥曲隨著制曲時(shí)間的增長(zhǎng)，其蛋白酶活力也逐漸增高，70 h時(shí)酶活最高。制曲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微生物進(jìn)入衰弱期，蛋白酶分泌量降低，同時(shí)蛋白質(zhì)降解過(guò)度，反而影響了小麥醬風(fēng)味。觀察曲霉孢子密度、顏色深淺、曲料香味，也可以確定最佳制曲時(shí)間為70 h。

3 結(jié)論

從自然發(fā)酵小麥醬曲中分離純化得到6種霉菌，對(duì)其進(jìn)行α-淀粉酶、糖化型淀粉酶、蛋白酶和酯化酶產(chǎn)酶能力的測(cè)定，經(jīng)綜合考慮，篩選出黃曲霉4號(hào)菌株為最適于單菌種發(fā)酵制小麥醬的菌株。研究接種黃4號(hào)曲霉制備小麥醬曲工藝，確定最佳制曲工藝參數(shù)為接種量4%，制曲時(shí)間70 h，制曲溫度32℃。在此條件下制得的小麥曲蛋白酶活力達(dá)到549 U/g，而自然發(fā)酵制曲的蛋白酶活力481 U/g。由此可見(jiàn)，篩選出的黃4號(hào)曲霉菌株經(jīng)過(guò)優(yōu)化工藝制曲，不僅縮短了制曲時(shí)間，同時(shí)提高了小麥曲的質(zhì)量，為小麥醬的進(jìn)一步發(fā)酵提供有益條件。

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CHEN Qingchan,JIAN Qingmei*,WANG Jinsong,SUN Aihong,LI Rong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

FourAspergillus flavusstrains and twoAspergillus nigerstrains were isolated from natural fermented wheat paste,and the physiological value of the strains were analyzed.Results showed thatA.flavus4 had the strongest ability to produce saccharifying amylase and protease,and strong ability to produce α-amylase and ester enzyme,which was suitable for fermenting wheat paste.The optimum fermentation conditions were strain inoculum 4%,starter-making temperature 32℃and time 70 h.Under this condition,the wheat starter protease activity was 549 U/g,which was much higher than that in the natural fermented koji(481 U/g).

wheat paste;Aspergillusstrains;koji making

TS264.2

A

0254-5071（2015）04-0086-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.019

2015-04-01

荊門市級(jí)研究與開(kāi)發(fā)引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（2013YD43）

陳清嬋（1983-），女，講師，博士，研究方向?yàn)轱L(fēng)味食品。

*通訊作者：簡(jiǎn)清梅（1975-），女，副教授，碩士，研究食品營(yíng)養(yǎng)與安全。