葛世杰，劉曉婷 ，張 沂 ，盧娜娜，顧立剛△，吳 珺，邱澤計(jì)，張洪春，晁恩祥

1北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)藥抗病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；2北京中日友好醫(yī)院

在流感病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒自身蛋白以及細(xì)胞分泌的信號(hào)分子均參與這一過(guò)程，如Fas-FasL腫瘤壞死因子(TNF)、天門(mén)冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白(Caspase)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶等，盡管許多蛋白質(zhì)被證明與流感病毒的凋亡有關(guān)，但尚缺乏進(jìn)一步的機(jī)制探討［1］。目前對(duì)中醫(yī)藥拮抗甲型H1N1流感病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用鮮有報(bào)道，本研究旨在探討疏風(fēng)宣肺方和解表清里方對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步闡明兩種不同治法方藥對(duì)流感的作用機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；McCoy's 5A培養(yǎng)基和胎牛血清(gibco公司，美國(guó))；0.25%胰酶-0.02%EDTA(Thermo公司，美國(guó)))；細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素混合物的完全McCoy′s 5A培養(yǎng)基)；細(xì)胞維持液 (含2.0%胎牛血清的McCoy′s 5A培養(yǎng)基)；1.5%雞紅細(xì)胞混懸液；PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa公司)；qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒 (北京澤平生物技術(shù)有限公司)；100 bp DNA ladder(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 流感病毒 甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株（由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所為本研究長(zhǎng)期低溫保存?zhèn)溆茫?；九日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后，病毒原液血凝滴度為1:128，TCID50=10-3.778。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 疏風(fēng)宣肺方由金銀花、連翹、牛蒡子、蟬蛻、荊芥等組成，并制備成顆粒劑；解表清里方由炙麻黃、生石膏、黃芩、杏仁、生甘草等組成，并制備成顆粒劑，顆粒劑由中日友好醫(yī)院藥廠(chǎng)制備；陽(yáng)性對(duì)照藥物磷酸奧司他韋膠囊(達(dá)菲)由瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏公司生產(chǎn)，批號(hào)：B1354，分裝批號(hào)：SH0037。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將A549細(xì)胞加細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)3～4次傳代后，細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)周期。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化細(xì)胞，洗脫后加入細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/mL接種于60mm培養(yǎng)皿中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后，使得細(xì)胞呈單層貼于孔底。取增殖旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 分組 本研究分為細(xì)胞對(duì)照組，H1N1感染組，奧司他韋對(duì)照組0.75μg/mL，疏風(fēng)宣肺組2.5μg/mL，解表清里組2.5μg/mL。除細(xì)胞對(duì)照組外，均使用流感病毒H1N1吸附2小時(shí)后，棄掉病毒液，PBS清洗2次后，加入上述濃度的藥物，作用24h后棄去上清，PBS清洗1次后，加入細(xì)胞裂解液，置-80℃冷凍過(guò)夜。

1.6 基因芯片分析 芯片實(shí)驗(yàn)由華聯(lián)生物科技股份有限公司完成，包括3次生物學(xué)重復(fù)。在樣本中提取各組細(xì)胞總mRNA后，在收集的樣本中提取細(xì)胞總RNA，定量并鑒定其完整性，保證無(wú)降解。RNA首先被反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光染料Cy3和Cys雙色熒光標(biāo)記，檢定熒光強(qiáng)度和標(biāo)記效率，進(jìn)行芯片雜交及掃描，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算探針信號(hào)在各組與模型組的強(qiáng)度比值。查找基因信息功能及生物路徑，篩選出與凋亡相關(guān)通路中密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。各組探針訊號(hào)的強(qiáng)度比值，以log2(Ratio)表示。與H1N1感染組比較，log2(Ratio)＞1，表示顯著上調(diào)的表達(dá)基因；log2(Ratio)＜-1，表示顯著下調(diào)的表達(dá)基因。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè) 設(shè)計(jì)引物序列：內(nèi)參GAPDH(136 bp)：上游 5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3′，下游 5′-GACTGTGGTCATGAGTCCT-3′；Caspase-3(131bp)：上游 5′-AGCACTGGAATGACATCTCG-3′，下 游 5′-CGCATCAATTCCACAATTTC-3′；Caspase-8(97bp)：上游 5′-TGCAAGAGGAAATCTCCAAA-3′，下游5′-TTTCCTTCTCCCAGGATGAC-3′；Caspase-9(99bp)：上游 5′-CTCAGACCAGAGATTCGCAA-3′，下游 5′-CTCA AGAGCACCGACATCAC-3′；Fas(93bp)：上游 5′-GAAC ACTGTGACCCTTGCAC-3′，下游 5′-TCTGGATCCTTCCTC TTTGC-3′；FasL(67bp)：上游 5′-AGAAGGAGCTGGCAG AACTC-3′，下游 5′-TGCTTCTCCAAAGATGATGC-3′。提取各組細(xì)胞總mRNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外自動(dòng)成像系統(tǒng)，啟動(dòng)自動(dòng)分析軟件，記錄目的基因擴(kuò)增條帶的灰度值，并分別計(jì)算內(nèi)參基因GAPDH值與各樣本目的基因的比值，統(tǒng)計(jì)目的基因表達(dá)的相對(duì)量，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

1.8 Western blot ting法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。封閉后加入 FAS、FAS-L一抗，4℃過(guò)夜。洗膜3次，加入漂洗液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，振蕩。將PVDF膜于室溫下振蕩溫育。ECL顯色，X線(xiàn)膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀(guān)察結(jié)果。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行吸光度分析，各目的條帶與GAPDH的吸光度比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(χ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片數(shù)據(jù)分析生物學(xué)路徑及部分經(jīng)典差異表達(dá)基因 通過(guò)KEGG pathway分析涉及細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑。與細(xì)胞對(duì)照組相比，H1N1感染組差異表達(dá)基因 Casp3、Casp8、Casp9及 Fas、FasL明顯上調(diào)，奧司他韋組、疏風(fēng)宣肺組和解表清里組對(duì)差異表達(dá)基因 Casp8、Casp7、Fas、FasL明顯下調(diào)，見(jiàn)表1。

2.2 疏風(fēng)宣肺方和解表清里方對(duì)甲型流感病毒H1N1感染的 A549 細(xì)胞中 Caspase-3、-8、-9 及Fas、FasL的mRNA表達(dá)的影響 與細(xì)胞對(duì)照組比較，H1N1感染組 Caspase-3、-8、-9及 Fas、FasL的 mRNA表達(dá)均顯著升高(P＜0.01)；與H1N1感染組比較，疏風(fēng)宣肺組的 Caspase-3、-8、-9及 Fas、FasL的mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，解表清里組對(duì) Caspase-3、-9及 Fas、FasL的 mRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，同時(shí)，疏風(fēng)宣肺組治療效果優(yōu)于解表清里組，見(jiàn)表2。

表1 甲型流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞后TLR3/7信號(hào)通路中基因轉(zhuǎn)錄的變化

表2 各組藥物對(duì)H1N1感染A549細(xì)胞中Caspase-3、-8、-9及Fas、FasL的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響(χ±s)

2.3 疏風(fēng)宣肺方和解表清里方對(duì)甲型流感病毒H1N1感染的A549細(xì)胞中Fas、FasL的蛋白表達(dá)H1N1感染組Fas、FasL蛋白較細(xì)胞對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)；與H1N1感染組比較，兩種方藥的Fas、FasL表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩種方藥對(duì)甲型流感病毒H1N1感染的A549細(xì)胞中Fas、FasL的Western blot蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

流感病毒侵犯呼吸道，因此呼吸道上皮細(xì)胞是最適于病毒增殖的靶細(xì)胞。但在體外實(shí)驗(yàn)中，病毒在不同細(xì)胞系中增殖特點(diǎn)不同，本實(shí)驗(yàn)選用適宜病毒增殖的人肺癌上皮細(xì)胞株A549進(jìn)行研究［2］。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生與A型流感病毒的線(xiàn)粒體蛋白 PB1-F2、NS1蛋白、M2蛋白密切相關(guān)。流感病毒感染MDCK細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肺泡及淋巴細(xì)胞，甚至腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)AS/FAS-L系統(tǒng)是激活靶細(xì)胞凋亡最主要的途徑。細(xì)胞表面重要的死亡受體FAS，與其配體 FASL結(jié)合后活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，通過(guò)線(xiàn)粒體通路和死亡受體通路以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑中上游的啟動(dòng)酶分別是Caspase-9和Caspase-8，凋亡下游效應(yīng)部分的執(zhí)行蛋白酶是Caspase-3［3］。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲型H1N1感染A549細(xì)胞可誘導(dǎo)Caspase-3、-8、-9及 Fas、FasL mRNA和蛋白大量表達(dá)，而疏風(fēng)宣肺方和解表清里方可顯著抑制甲型 H1N1誘導(dǎo)引起的 Caspase-3、-9及 Fas、FasL mRNA和蛋白表達(dá)，具有明顯的抗細(xì)胞凋亡作用，且細(xì)胞毒性較低。而疏風(fēng)宣肺方的抗細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于解表清里方，印證了臨床研究的平行隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照的結(jié)果［4］。凋亡的分子機(jī)制是涉及多種信號(hào)途徑的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，本研究?jī)H探討了2種方藥對(duì)凋亡受體途徑FAS/FAS-L系統(tǒng)的影響。還有報(bào)道稱(chēng)，流感病毒利用有活性的NF-κB，介導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α/β，促進(jìn)感染細(xì)胞的凋亡，維持病毒自身的生存［5］；流感病毒感染后細(xì)胞內(nèi)IL-6的活性也增強(qiáng)，且其變化趨勢(shì)與Fas的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)相一致，IL-6很可能是Fas啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)因子［6］。本研究前期結(jié)果表明，疏風(fēng)宣肺方和解表清里也可能通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路和抑制IL-6分泌而下調(diào)Fas和FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

疏風(fēng)宣肺方是在銀翹散基礎(chǔ)上，加減化裁而成。方中主要藥物黃芩、連翹和金銀花對(duì)100TCID50甲3型流感病毒所誘導(dǎo)的MDCK晚期細(xì)胞凋亡有顯著抑制作用［7］；板藍(lán)根凝集素對(duì)甲型流感病毒血凝素活性有抑制作用，并通過(guò)免疫調(diào)節(jié)間接抗病毒［8］。解表清里方是在麻杏石甘湯基礎(chǔ)上加減化裁而成，麻杏石甘湯能顯著降低流感病毒感染的MDCK細(xì)胞的凋亡百分率，同時(shí)，也能通過(guò)促進(jìn)IFN-γ以增強(qiáng)TNF-α等細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)［9］。兩種方藥中均含有黃芩，具有拮抗甲型流感病毒抑制的細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期分布，通過(guò)抑制Caspase-8的激活，進(jìn)一步抑制Caspase-3活性，從而抑制流感病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［10］。細(xì)胞凋亡涉及眾多基因，網(wǎng)絡(luò)狀信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控模式非常復(fù)雜，因此，疏風(fēng)宣肺方和解表清里方對(duì)H1N1感染的細(xì)胞凋亡的機(jī)制有待深入研究。

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