甘曉云，伍錫棟，劉 濤綜述，張五萍△審校

（1.江西省人民醫(yī)院藥劑科，南昌330006；2.江西省藥物研究所藥理室，南昌330006）

在20世紀90年代初，美國的Tuerk等［1－2］在實驗室中發(fā)明了一種叫做指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)，由此技術(shù)篩選出來的寡核苷酸命名為適配子（aptamers）。適配子可以和抗體媲美，甚至優(yōu)于抗體。具有以下特點［3］：（1）可以保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)屬性，性能穩(wěn)定，可以常溫運輸、長期保存；（2）篩選適配子過程簡單，周期短（一般2個月左右）；（3）相對分子質(zhì)量比抗體分子小，具有快速的血漿清除率、高組織穿透力、免疫原性低、變性可逆（數(shù)分鐘內(nèi)可以再生，因此可以反復(fù)使用）；（4）可在適配子中插入基因組或化學(xué)合成修飾（鏡像異構(gòu)適配子、糖基化、連接在大分子載體等方法）實現(xiàn)多層面調(diào)控，可直接用于生物檢測、診斷及腫瘤靶向治療。現(xiàn)結(jié)合腫瘤方面闡述細胞SELEX（Cell-SELEX）及其適配子在腫瘤研究中的應(yīng)用及意義。

1 采用Cell-SELEX技術(shù)篩選適配子

Cell-SELEX技術(shù)是將整個細胞作為靶標篩選出特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子的方法，該技術(shù)可以不需要了解靶細胞的分子組成、蛋白結(jié)構(gòu)及其他差異性信息，其核心技術(shù)是利用任意2種完整的活細胞膜表面分子水平之間的差異來篩選能特異性識別靶細胞的適配子，以準確地區(qū)分正常細胞和靶細胞。具體方法：將體外用組合化學(xué)的方法合成隨機寡核苷酸序列DNA／RNA作為篩選的原庫，與靶細胞（一般選擇過表達細胞）孵育以篩掉不與靶細胞結(jié)合的序列，再與同源細胞系為對照細胞（一般選擇低表達／不表達細胞）孵育以篩掉與靶細胞和對照細胞都結(jié)合的序列，得到的特異性序列經(jīng)過體外PCR／RT-PCR擴增技術(shù)，得到的雙鏈PCR樣品，經(jīng)過8%尿素膠／鏈霉親和素磁珠分離等方法得到單鏈DNA／RNA用于下一輪篩選的次文庫。經(jīng)過多輪篩選（一般5～20輪），最終獲得的單鏈DNA／RNA進行克隆測序，分析序列同源性得到與靶細胞高親和力、特異性強結(jié)合的適配子。

2 在標志物發(fā)現(xiàn)上的應(yīng)用

2.1 在腫瘤標志物上的應(yīng)用 由于在癌變的過程中，相關(guān)的基因表達異常導(dǎo)致了癌細胞各種表面分子尤其是蛋白水平的改變。陳文學(xué)等［4］應(yīng)用熒光標記適配子，與流式細胞技術(shù)結(jié)合，對正常鼻咽癌上皮細胞株與鼻咽癌細胞株進行Cell-SELEX消減篩選出特異性適配子。目前，應(yīng)用Cell-SELEX技術(shù)篩選得到了針對腫瘤相關(guān)蛋白血小板衍生生長因子（plateletderived growth factors，PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、HER3、NF-κB、Tenascin-C、Nucleolin以及甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）［5］、黏蛋白1（mucin1，MUC1）等核酸適配子已廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷和靶向治療研究［6］。

2.2 在病毒、細菌標志物上的應(yīng)用［7］近年來，在人類免疫缺陷病毒（HIV）gag相關(guān)蛋白、大腸桿菌以及抗菌藥物（四環(huán)素、新霉素和青霉素類抗菌藥物等）等方面多有報道。Handy等［8］用毒素－蛋白聯(lián)合物的方法篩選出首個海洋毒素STX的適配體，并且能運用到食源性毒素檢測中。適配子與靶分子結(jié)合能力強，解離度常數(shù)（kd）常在pmol／L～nmol／L之間。Hamula等［9］運用改良Cell-SELEX篩選出嗜酸乳酸菌的完整活細胞的適配體，其平均解離系數(shù)為 （13±3）nmol／L，并得到hemag1P特異性和親和力最高。Khati等針對變異株病毒gp120部分保守區(qū)域（結(jié)合細胞因子）篩選得到2′F-RNA適配子不但能高親和力結(jié)合gp120，而且將抑制HIV-1感染人外周血單核細胞（PBMCs）的活性提高了1 000倍。Wang等［10］篩選出朊病毒蛋白的適配子，可以特異識別不同構(gòu)象的朊蛋白，避免了抗體的局限性，因而有可能用于瘋牛病等疾病的診斷。

3 在腫瘤診斷中的應(yīng)用

3.1 適配子與生物工具結(jié)合性診斷應(yīng)用 目前，Cell-SELEX篩選得到的適配子應(yīng)用在診斷上主要有流式細胞分析法、生物／壓電生物傳感器、生物質(zhì)譜、表面增強拉曼散射等。核酸適配子具有優(yōu)越于抗體獨特的性質(zhì)，結(jié)合現(xiàn)代細胞遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)的MICM等技術(shù)，使得診斷手段由細胞水平上升到亞細胞水平及分子水平。諸如生物傳感器技術(shù)的發(fā)展，核酸適配子－生物芯片復(fù)合物等在臨床診斷上的應(yīng)用，與Cell-SELEX技術(shù)在臨床診斷上取得了較好效果，如劉星等［11］用生物傳感器-SELEX技術(shù)對弓形蟲（TOX）等進行了多通道間檢測，檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性良好，線性檢測范圍理想。有報道核酸適配子也可以制成生物芯片，用于體內(nèi)分子成像研究，能特異性地同時定量檢出3種混于血清和細胞提取物中腫瘤相關(guān)蛋白（次黃嘌呤單磷酸脫氫酶Ⅱ、血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維生長因子）。

3.2 適配子作為探針性診斷應(yīng)用 基于適配子的特異性識別功能，可以設(shè)計出很多應(yīng)用在臨床上檢測診斷的新方法，如以熒光染料［12］、納米粒子及電化學(xué)活性探針等多種探針性應(yīng)用形式增加檢測靈敏度。Shi等［13］利用TD05與熒光染料Cy5組成Cy5-TD05探針成功用于B細胞性淋巴瘤移植小鼠的體內(nèi)分子成像，可以更準確地靶向診斷腫瘤；Gao等［14］合成的適配子GMT8-納米粒子能有效定位于惡性膠質(zhì)瘤移植小鼠的腫瘤位點；Chen等［15］用連有抗肝癌細胞核酸適配體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）納米粒實現(xiàn)了對不同腫瘤細胞的檢測；Avci-Adali等［16］設(shè)計了一個可激活的核酸適配體熒光探針用于體內(nèi)腫瘤成像，這種探針只有在與細胞膜表面蛋白結(jié)合后，才會引起探針上的熒光分子激發(fā)，從而用于腫瘤早期組織的檢測診斷。諸多適配子的探針性檢測方法不僅靈敏度高，而且特異性強，對腫瘤發(fā)生的早期診斷和防治具有積極的意義。

4 在腫瘤治療中的應(yīng)用

近來研究發(fā)現(xiàn)，第1個通過美國食品藥品管理局（FDA）批準的適配子藥物 Macugen［17］對糖尿病性黃斑水腫、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病和視網(wǎng)膜靜脈狹窄也有一定的治療效果［18］。目前，針對核仁蛋白的AS1411適配子已經(jīng)進入臨床試驗。靶向藥物可以提高腫瘤的治療效率，降低藥物治療產(chǎn)生的毒副作用，適配子與細胞的結(jié)合具有很好的靶向性，常與現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于腫瘤靶向治療中，本身作為靶向材料／運輸工具與化療藥物耦聯(lián)形成軛合物，以及應(yīng)用于納米脂質(zhì)體、小分子干擾RNA等技術(shù)。

適配子具有相對安全、血漿清除率快、組織穿透力強、價格適中等優(yōu)點。Meng等［19］將適配子TLS11a-GC與多柔比星組成TLS11a-GC-Dox軛合物能特異性結(jié)合肝癌細胞LH86并抑制肝癌細胞增長；Gao等［14］借助納米分子生物化學(xué)技術(shù)，合成適配子GMT8-多西紫杉醇－納米粒子靶向藥物提呈系統(tǒng)以誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細胞凋亡和抑制腫瘤生長；Rao等［20］通過脂質(zhì)體法將抗HPV16-E6核酶、空載體質(zhì)粒分別導(dǎo)入宮頸癌CaSki細胞，對照發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染核酶的CaSki細胞E6基因的表達明顯減少，對化療藥物順鉑敏感性增加了2 128倍，細胞凋亡率明顯增加；Zhang等［21］以乳腺癌細胞 MCF-10ATI為靶細胞篩選出的適配子KMF2-1a能特異運送大分子鏈霉親和素進入靶細胞，若將KMF2-1a結(jié)合其他介質(zhì)如化療藥物用于乳腺癌診治或許能產(chǎn)生靶向治療的作用；Kurosaki等［22］研發(fā)出一種由質(zhì)粒DNA、聚乙烯亞胺和MUCI組成的腫瘤靶向基因輸送系統(tǒng)，顯著抑制表達MUCI人類肺癌細胞株A549細胞的生長。

5 適配子的應(yīng)用前景

目前，適配子實際應(yīng)用仍受諸多限制，在人體內(nèi)使用的安全性以及穩(wěn)定性等評價尚需做很多工作。近20年來，Cell-SELEX技術(shù)在不斷地革新，尤其是新型的分子生物技術(shù)以及材料等高科技技術(shù)的不斷發(fā)展，如流式細胞分析技術(shù)、原子力顯微鏡技術(shù)、小分子RNA干擾技術(shù)以及生物芯片、納米技術(shù)等前沿技術(shù)的發(fā)展，適配子篩選技術(shù)將能很好地促進腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)、早期診斷以及靶向治療。Cell-SELEX篩選技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)組合的新技術(shù)也在不斷出現(xiàn)，諸如與光學(xué)適體傳感器的結(jié)合、生物共振、免疫組織化學(xué)熒光等多重組合。相信隨著針對適配子在腫瘤研究的不斷深入，越來越多針對腫瘤、病毒以及細菌等靶分子篩選的適配子將被更多地應(yīng)用于臨床，對腫瘤的臨床診斷治療及藥物的研究開發(fā)都將帶來更廣闊的前景。

［1］ Tuerk C，Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase［J］.Science，1990，249（4968）：505-510.

［2］ Ellington AD，Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands［J］.Nature，1990，346（6287）：818-822.

［3］ Sefah K，Shangguan D，Xiong X，et al.Development of DNA aptamers using Cell-SELEX［J］.Nat Protoc，2010，5（6）：1169-1185.

［4］ 陳文學(xué)，張焜和，鄒學(xué)森，等.SELEX法篩選鼻咽癌核酸適配子的研究［J］.山東醫(yī)藥，2012，52（23）：31-33.

［5］ Lee YJ，Lee SW.Regression of hepatocarcinoma cells using RNA aptamer specific to alpha-fetoprotein［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，417（1）：521-527.

［6］Syed MA，Pervaiz S.Advances in aptamers［J］.Oligonucleotides，2010，20（5）：215-224.

［7］ Ni X，Castanares M，Mukherjee A，et al.Nucleic acid aptamers：clinical applications and promising new horizons［J］.Curr Med Chem，2011，18（27）：4206-4214.

［8］ Handy SM，Yakes BJ，DeGrasse JA，et al.First report of the use of a saxitoxin-protein conjugate to develop a DNA aptamer to a small molecule toxin［J］.J Int Soc Toxinol，2013，61：30-37.

［9］ Hamula CL，Zhang H，Guan LL，et al.Selection of aptamers against live bacterial cells［J］.Anal Chem，2008，80（20）：7812-7819.

［10］Wang P，Hatcher KL，Bartz JC，et al.Selection and characterization of DNA aptamers against PrP（Sc）［J］.Exp Biol Med（Maywood），2011，236（4）：466-476.

［11］劉星，秦蓮花，羅陽，等.快速檢測TOX、CM VIgG抗體的適配子型SPR傳感器微陣列的初步構(gòu)建［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2012，34（8）：765-767.

［12］王麗，張存政，劉媛，等.基于分子信標的有機磷農(nóng)藥適配體活性位點分析及改造［J］.分析化學(xué)，2012，40（6）：940-944.

［13］Shi H，Tang ZW，Kim YM，et al.In vivo fluorescence imaging of tumors using molecular aptamers generated by cell-SELEX［J］.Chemistry-An Asian J，2010，5（10）：2209-2213.

［14］Gao H，Qian J，Yang Z，et al.Whole-cell SELEX aptamerfunctionalised poly（ethyleneglycol）-poly（ε-caprolactone）nanoparticles for enhanced targeted glioblastoma therapy［J］.Biomaterials，2012，33（26）：6264-6272.

［15］Chen X，Estévez MC，Zhu Z，et al.Using aptamer-conjugated fluorescence resonance energy transfer nanoparticlesfor multiplexed cancer cell monitoring［J］.Anal Chem，2009，81（16）：7009-7014.

［16］Avci-Adali M，Paul A，Wilhelm N，et al.Upgrading SELEX technology by using lambda exonuclease digestion for single-stranded DNA generation［J］.Molecules，2009，15（1）：1-11.

［17］Ng EW，Shima DT，Calias P，et al.Pegaptanib，a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5（2）：123-132.

［18］Zechmeister-Koss I，Huic M.Vascular endothelial growth factor inhibitors（anti-VEGF）in the management of diabetic macular oedema：a systematic review［J］.Br J Ophthalmol，2012，96（2）：167-178.

［19］Meng L，Yang L，Zhao XX，et al.Targeted delivery of chemotherapy agents using a liver cancer-specific aptamer［J］.PLoS One，2012，7（4）：e33434.

［20］Rao ZG，Gao JF，Zhang BC，et al.Cisplatin sensitivity and mechanisms of anti-HPV16E6-ribozyme on cervical carci-noma CaSKi cell line［J］.Chinese-German J Clin Oncol，2012，11（4）：237-242.

［21］Zhang K，Sefah K，Tang L，et al.A novel aptamer developed for breast cancer cell internalization［J］.Chem Med Chem，2012，7（1）：79-84.

［22］Kurosaki T，Higuchi N，Kawakami S，et al.Self-assemble gene delivery system for molecular targeting using nucleic acid aptamer［J］.Gene，2012，491（2）：205-209.