高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測(cè)定茶葉中高關(guān)注的25種農(nóng)藥殘留

丁　琳

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 福建 廈門 361100)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測(cè)定茶葉中高關(guān)注的25種農(nóng)藥殘留

丁琳

(廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 福建 廈門 361100)

摘要:本文建立了茶葉中25種常用農(nóng)藥多殘留同時(shí)檢測(cè)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。樣品以乙腈作為提取劑，經(jīng)石墨化炭固相萃取小柱凈化，采用phenomenex C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 A)分離，以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，以電噴霧電離(ESI)、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)，外標(biāo)法定量。25種農(nóng)藥在5-200 μg/L范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性良好。分析目標(biāo)物添加水平為0.01-0.10 mg/kg時(shí)，回收率范圍為70%-116%,RSD范圍為4.3%-10.8%,符合殘留分析的要求。25種農(nóng)藥的定量下限(S/N>10)為0.01 mg/kg。該方法的提取效果好、凈化較徹底，靈敏度滿足國(guó)內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，適合茶葉中常用農(nóng)藥殘留的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞:高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 茶葉； 農(nóng)藥殘留

Determination of 25 highly attentive pesticide

中國(guó)是茶的發(fā)源地，具有幾千年的產(chǎn)茶歷史，其中茶葉生產(chǎn)面積和總產(chǎn)量均居世界第一位，年出口量居世界第二位。為了防治茶樹的各種病蟲害，化學(xué)農(nóng)藥在茶園中廣泛使用。日本和歐盟作為我國(guó)茶葉的重要進(jìn)口國(guó)，近年來(lái)制定了許多農(nóng)藥最大殘留標(biāo)準(zhǔn)，并不斷進(jìn)行修訂，農(nóng)藥殘留限量非常苛刻。如歐盟2008年9月1日實(shí)施的農(nóng)藥殘留限量法規(guī)(EC)No.149/2008中涉及茶葉的現(xiàn)行農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)共392項(xiàng)(童小麟等，2009)，其中啶蟲脒、吡蟲啉、噻嗪酮、噠螨靈的最高殘留限量(MRL)分別為0.1、0.05、0.05、0.05 mg/kg，而2013年4月16日修訂的(EC)No.799/2011中，更將氟樂(lè)靈的MRL由0.1 mg/kg更改為0.05 mg/kg。另外日本的《肯定列表制度》中與茶葉相關(guān)的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)也有251種(謝爭(zhēng)珍，2008)，其中氟蟲腈、茚蟲威、三唑磷的MRL分別為0.002、0.01、0.01 mg/kg。針對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，我國(guó)2014年8月1日正式實(shí)施的GB 2763-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中涉及茶葉的農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)也有28項(xiàng)。因此，建立一個(gè)快速、準(zhǔn)確的農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法十分必要。

目前，國(guó)內(nèi)外涉及以上幾種常用農(nóng)藥的檢測(cè)方法有氣相色譜法(GC)(龔雪蓮，2007；葉江雷等，2005)、高效液相色譜法(HPLC)(王孝輝等，2012；蘇婷等，2011)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)(GB/T23204-2008；蔣俊樹等，2009)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)(胡貝貞等，2012；賈偉等，2013；GB/T23205-2008)等。其中GC和HPLC的方法靈敏度較低，選擇性差，不適用于多種農(nóng)藥殘留痕量分析的要求； GC-MS和LC-MS由于難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息，定性準(zhǔn)確度方面尚有欠缺，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果；而LC-MS/MS因同時(shí)具有靈敏度高和選擇性高的特點(diǎn)，適用于分析基質(zhì)復(fù)雜，背景干擾嚴(yán)重的痕量化合物。本文依據(jù)目前我國(guó)茶葉農(nóng)藥的使用情況，以高度關(guān)注的農(nóng)藥項(xiàng)目為研究對(duì)像，研究建立了茶葉中25種常用農(nóng)藥的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-HPLC -MS/MS)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)提取和凈化方法進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)估，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

電噴霧串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(API 4000 Q trap，美國(guó)Applied Biosystems 公司)配高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國(guó)Agilent公司)；高速渦旋振蕩儀(IKA MS3 basic，德國(guó)IKA公司)；離心機(jī)(Anke TDL-40B,上海安亭科學(xué)儀器廠)；氮吹儀(TurboVap LV，美國(guó)Zymark公司)；超純水發(fā)生器(Milli-Q，美國(guó)Millipore公司)，ENVI-Carb石墨炭柱(0.5 g，6 mL，美國(guó)Supelco公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(純度大于98%,德國(guó)Fluka公司)，實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。所檢測(cè)的25種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：分別準(zhǔn)確稱適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成約100 mg/L的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中保存，根據(jù)實(shí)際需，用乙腈逐級(jí)稀釋成相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2樣品處理

1.2.1提取稱取1.0 g均勻的茶葉試樣(經(jīng)超離心研磨儀粉碎后過(guò)2.0 mm篩)于聚四氟乙烯離心管中，加入15 mL乙腈，振蕩提取2 min，以4000 r/min離心2 min，取上層溶液于25 mL帶刻度玻璃試管中，再加入10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，40 ℃氮吹濃縮至約2 mL。

1.2.2凈化將ENVI-Carb小柱裝在固相萃取裝置上，先用3 mL乙腈預(yù)淋洗活化小柱，保持流速約為1 mL/min，將提取液過(guò)ENVI-Carb小柱，再用9 mL乙腈洗脫，收集所有流出物于15 mL玻璃試管中，于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(1:1，v/v)溶解殘?jiān)^(guò)0.22μm微孔濾膜，濾液供LC-MS/MS分析。

1.3檢測(cè)條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex Kinetex C18 柱(50 mm×2.1 mm,2.6 μm，100 A)；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：400 μL/min。梯度洗脫程序：0-0.1 min，90%A-20%A；0.1 min-4.0 min，保持20%A；4.0 min-4.1 min，20%A-90%A；4.1 min-9.0 min，保持90%A。

1.3.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；電噴霧電壓：5500 V；離子源溫度：550 ℃。各組分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1　25種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)

注：其中*表示定量離子

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理方法的選擇

2.1.1萃取條件的選擇本文所檢測(cè)的25種農(nóng)藥多屬于弱極性或中等極性，常用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等。本文分別采用甲醇、乙腈、丙酮-二氯甲烷(1:1，v/v)三種溶劑對(duì)茶葉中25種農(nóng)藥殘留物提取效果進(jìn)行比較。以不含農(nóng)藥殘留的茶葉樣品作為基質(zhì)，進(jìn)行測(cè)定低限水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，每種溶劑做2個(gè)平行，記錄兩個(gè)結(jié)果的平均值，其中乙腈和丙酮-二氯甲烷(1:1，v/v)的提取效率較高，回收率均可達(dá)到70%以上，但丙酮-二氯甲烷(1:1，v/v)提取的雜質(zhì)較乙腈多，丙酮與水互溶，不利于下一步的濃縮凈化，且二氯甲烷毒性較大，不利人體健康和環(huán)保，故選擇乙腈為本實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。不同提取溶劑對(duì)4種代表性農(nóng)藥提取效果的比較如圖1所示。

圖1　不同提取溶劑對(duì)4種代表性農(nóng)藥提取效果的比較

2.1.2凈化條件的選擇茶葉樣品經(jīng)溶劑提取后，提取溶液中存在大量色素，故需凈化以降低基體效應(yīng)對(duì)檢測(cè)帶來(lái)的影響。本文比較了PSA、氨基、C18和石墨化炭黑固相萃取小柱對(duì)茶葉提取液的凈化效果。通過(guò)添加回收率考察凈化結(jié)果。其中經(jīng)C18柱凈化的樣品回收率比未過(guò)柱的回收率略低，C18屬于反相柱，可有效去除基質(zhì)中的脂類等非極性有機(jī)物，而茶葉中這類有機(jī)物含量較低，故凈化效果不明顯，還易引起目標(biāo)農(nóng)藥的損失。經(jīng)PSA柱和氨基柱凈化的樣品回收率與未過(guò)柱的樣品相當(dāng)，但凈化效果有限，提取液仍呈墨綠色，易造成儀器污染。而經(jīng)石墨化炭柱凈化的樣品色素基本除去，提取液為透明淡黃色，且回收率較未經(jīng)凈化的樣品普遍略有提高，譜圖基線平穩(wěn)。故本實(shí)驗(yàn)采用ENVI-Carb固相萃取小柱凈化提取液。不同固相萃取柱對(duì)4種代表性農(nóng)藥凈化效果的比較如圖2所示。

圖2　不同固相萃取柱對(duì)4種代表性農(nóng)藥凈化效果的比較

圖3　茶葉空白樣品和25種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流(TIC)色譜圖

圖4　4種代表性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

2.2檢測(cè)條件的選擇

根據(jù)待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定25種化合物均適合在ESI源的正離子模式下電離，依據(jù)電噴霧電離的機(jī)理，以利于化合物去質(zhì)子化的乙腈為有機(jī)相。并在流動(dòng)相中加入甲酸和乙酸銨考察目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入乙酸銨目標(biāo)化合物的響應(yīng)值降低，而加入0.1%甲酸，有利于化合物在正離子模式下，有更好的離子化效率，可提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，并改善峰形，故本實(shí)驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相。圖3為茶葉空白樣品和25種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流(TIC)色譜圖，圖4為4種代表性農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖。

2.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與定量限

在確定的最佳儀器分析條件下，配制25種農(nóng)藥濃度依次為5.0、10、50、100、200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)組分的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，25種農(nóng)藥質(zhì)量濃度在5.0-200 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。用本茶葉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以信噪比(S/N)≥10確定25種農(nóng)藥的定量下限均可達(dá)到0.01 mg/kg。

表2　25種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4回收率與精密度

在陰性茶葉樣品中添加不同濃度的25種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中農(nóng)藥含量的濃度為10、50、100 μg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平濃度下做6個(gè)平行樣，結(jié)果表明目標(biāo)分析物的回收率均在70%-116%范圍內(nèi)，變異系數(shù)在4.3%-10.8%之間?；厥章逝c精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。25種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2。

2.5實(shí)際應(yīng)用

利用建立的分析方法，對(duì)100多個(gè)日常茶葉樣品中的25種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了檢測(cè)。在相同儀器條件下，樣品的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)物質(zhì)的保留時(shí)間一致；且樣品中各組分監(jiān)測(cè)離子對(duì)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)物質(zhì)離子對(duì)的豐度比接近時(shí)，可判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。其中檢出率較高的農(nóng)藥殘留包括噠螨靈(0.010-0.22 mg/kg)、噻嗪酮(0.013-0.062 mg/kg)、吡蟲啉(0.010-0.14 mg/kg)、啶蟲脒(0.021-0.52 mg//kg)及唑蟲酰胺(0.025-0.30 mg/kg)。一個(gè)代表性陽(yáng)性樣的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。

圖5　一個(gè)陽(yáng)性樣品的MRM圖(檢出物：唑蟲酰胺)

3結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)茶葉中25種農(nóng)藥殘留的方法。采用乙腈提取，石墨化炭固相萃取小柱凈化，在質(zhì)譜正離子模式下9 min內(nèi)完成分離檢測(cè)，25種農(nóng)藥的檢出限均能達(dá)到0.01 mg/kg。與其他儀器法比較，串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，有效降低了由儀器檢測(cè)所產(chǎn)生假陽(yáng)性的可能，保證了定性和定量結(jié)果的可靠性，適用于茶葉這種復(fù)雜基體的檢測(cè)。方法采用phenomenex 50 mm短柱，分析時(shí)間短，簡(jiǎn)單快捷，適用于大量樣品的多殘留快速篩查。綜上，本文為茶葉多殘留同時(shí)檢測(cè)提供了一種切實(shí)可行的方法。

致謝：

本研究得到徐敦明研究員的大力支持和指導(dǎo)，特此致謝！

參考文獻(xiàn)

龔雪蓮.2007.氣相色譜法在測(cè)定茶葉農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, (5):55-58.

胡貝貞,蔡海江,宋偉華.2012.茶葉中氟蟲腈等8種農(nóng)藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定及不確定度評(píng)定.色譜,30( 9):889-895.

蔣俊樹, 趙彬,周莉.2009.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中36種農(nóng)藥殘留.食品科學(xué),30(14):276-280.

賈瑋,黃峻榕,凌云,馮峰,鄭月明,儲(chǔ)曉剛.2013.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中290種農(nóng)藥殘留組分.分析測(cè)試學(xué)報(bào),32(1):9-22.

蘇婷, 侯如燕,趙秀霞,錢曉三,楊婷婷.2011.茶葉、茶鮮葉及茶湯中啶蟲脒殘留的檢測(cè).食品與發(fā)酵工業(yè),37(10):174-177.

童小麟,鄒偉.2009.歐盟新的茶葉農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)分析與對(duì)策研究.檢驗(yàn)局檢疫學(xué)刊,19(3):56-59.

王孝輝, 宛曉春,侯如燕.2012.茶葉中吡蟲啉農(nóng)藥殘留的液相色譜檢測(cè)方法.茶葉科學(xué),32(3):203-209.

謝爭(zhēng)珍. 2008.中國(guó)輸日茶葉貿(mào)易及影響因素研究.茶葉,34(4): 225-229.

葉江雷,弓振斌,沈愛(ài)斯.2005.茶葉中9種農(nóng)藥殘留的毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定.分析儀器,( 2): 20-23.

GB/T 23204-2008,茶葉中519種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定，氣相色譜-質(zhì)譜法.

GB/T 23205-2008,茶葉中448種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.

(責(zé)任編輯：陳曉雯)

丁琳.2015.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法測(cè)定茶葉中高關(guān)注的25種農(nóng)藥殘留.武夷科學(xué)，31：182-189.

residues in tea by high performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

Lin DING

(InspectionandQuarantineTechnologyCenter,XiamenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,

Xiamen,Fujian361100,China)

Abstract:A method was developed for the simultaneous determination of 25 pesticide residues in tea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The sample was extracted with acetonitrile and cleaned-up with a Carb solid phase extraction (SPE) column. The analytes were separated on a phenomenex C18 column(50 mm×2.1 mm,2.6 μm,100 A)and eluted with the gradient solution of acetonitrile and 0.1% formic acid. The 25 pesticides were determined in the modes of electrospray ionization (ESI) and multiple reaction monitoring (MRM). The analytes were quantified by matrix-matched external standard method. The calibration curves of 25 pesticide residues were linear in the range of 5-200 μg/L with correlation coefficients higher than 0.99. The average recoveries ranged from70% to 116% with the relative standard deviations of 4.3%-10.8% at the spiked levels of 0.01-0.10 mg/kg for all compounds. The limits of quantitation (LOQs, S/N>10) for 25 pesticides were 0.01 mg/kg. The method developed is suitable for the conformation and quantification of the residual pesticides in tea.

Key words:high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; tea; pesticide residues

中圖分類號(hào):O657.63; TS272.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào)：1001-4276-(2015)01-0182-08

作者簡(jiǎn)介:丁琳(1984-)，女，學(xué)士，工程師。研究方向：食品安全檢測(cè)。Email： jszx-ta-dingl@xmciq.gov.cn。

收稿日期：2015-09-09; 發(fā)表日期：2015-10-31