張毅，譚加興，葉彥愷，姜煒，孫艷華，沈萬秋，曹海燕，靳美娜，秦楠，段宏泉

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)用化學(xué)教研究，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

論著

基于納米粒子的TR-FRET傳感器用于miRNAs的無擴(kuò)增檢測(cè)

張毅，譚加興，葉彥愷，姜煒，孫艷華，沈萬秋，曹海燕，靳美娜，秦楠，段宏泉

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)用化學(xué)教研究，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

目的：建立一種基于納米粒子的時(shí)間分辨（TR）熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）生物傳感器用于miRNAs的無擴(kuò)增檢測(cè)。方法：以寡核苷酸單鏈probe I偶聯(lián)GdF3：Tb3+納米粒子作為供體，以寡核苷酸單鏈probe II偶聯(lián)金（Au）納米粒子作為受體，利用供體與受體之間的FRET檢測(cè)目標(biāo)miRNA hsa-miR-122-5p濃度，并通過設(shè)置多功能酶標(biāo)儀的檢測(cè)延遲去除自發(fā)熒光背景以提高靈敏度。結(jié)果：該傳感器能夠高靈敏度、高特異性地檢測(cè)目標(biāo)分子，并且對(duì)于光照有良好的耐受性，而且能夠避免自發(fā)熒光干擾。對(duì)hsa-miR-122-5p的檢測(cè)線性范圍為0.1 fmol/L～100 pmol/L，與同類型的RNA熒光傳感器的檢測(cè)限具有可比性。結(jié)論：基于納米粒子的TR-FRET生物傳感器用于miRNAs的無擴(kuò)增檢測(cè)具有良好的靈敏度和特異性。

鑭系金屬摻雜；納米粒子；時(shí)間分辨；熒光共振能量轉(zhuǎn)移；miRNA；傳感器；無擴(kuò)增檢測(cè)

微核糖核酸（miRNAs）是一類由內(nèi)源基因編碼的、長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它在細(xì)胞分化、增殖和凋亡以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等病理過程中都起到非常重要的調(diào)控作用[1]。有研究表明，某些miRNAs可以介導(dǎo)腫瘤的擴(kuò)增和擴(kuò)散，與多藥耐藥密切相關(guān)，可以調(diào)節(jié)癌癥轉(zhuǎn)移過程中多個(gè)基因的表達(dá)，這些miRNAs很有可能成為預(yù)測(cè)癌癥的重要指標(biāo)[2-3]。目前，miRNAs的檢測(cè)手段主要包括反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)[4]、微陣列[5]、電化學(xué)[6]、熒光法[7-8]等。其中，相比其他3種方法，熒光法具有成本低廉、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等明顯優(yōu)勢(shì)。本文旨在報(bào)道一種基于鑭系金屬摻雜納米粒子的時(shí)間分辨（TR）型熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）生物傳感器用于檢測(cè)miRNAs。該傳感器的優(yōu)勢(shì)在于其能夠有效地避免來自體液、細(xì)胞和組織樣本的散射光以及自發(fā)熒光干擾，無需擴(kuò)增miRNAs，無需避光保存。

1 材料與方法

1.1 試劑及樣本 所有合成RNA及DNA均購于金唯智生物科技有限公司（北京）。其他所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水由Labconco WaterPro水系統(tǒng)制備。GdCl3×6H2O，TbCl3×6H2O，NH4F，聚丙烯酸（PAA，分子量～2 000），1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）購自上海阿拉丁試劑有限公司。鹽酸，EDTA，Na2HPO4×12H2O，NaH2PO4×2H2O，NaOH，NaCl，MgCl2,檸檬酸鈉購自天津光復(fù)試劑有限公司。酵母tRNA購自北京華越洋生物科技有限公司。RNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司。qRT-PCR試劑盒為TaqManRMicroRNA Assay，SM，貨號(hào)4427975。一位健康人和一位慢性淋巴性白血病（CCL）患者血清各兩份，購于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院（天津）。本工作所涉及的核苷酸序列見表1。

表1 核苷酸序列Tab 1 Sequences of RNA and DNA

1.2 儀器 Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀，雷勃爾LG16-A高速臺(tái)式離心機(jī)，熒光定量PCR儀ABI7000。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PAA-GdF3：Tb3+納米粒子的合成 本合成參考了文獻(xiàn)方法[9]，并做了部分改動(dòng)。具體步驟如下：在50 mL圓底燒瓶中，向12 mL超純水和4.0 mL乙二醇混合溶劑中加入0.1 mmol GdCl3×6H2O、80 mg PAA、2.0 μmol TbCl3×6H2O，攪拌至均勻透明后加熱至50℃。另取一支15 mL試管中加入2.0 mL乙二醇、5.0 mL超純水和0.3 mmol NH4F，室溫?cái)嚢柚辆鶆蛲该骱蠹訜嶂?0℃，趁熱將此NH4F溶液滴加入上述圓底燒瓶中，持續(xù)反應(yīng)30 min后2 000 r/min離心5 min，收集固體產(chǎn)物，并分別用超純水和乙醇各洗滌兩遍，真空干燥過夜。最后得到PAA修飾的GdF3：Tb3+納米粒子白色粉末狀產(chǎn)物。

1.3.2 寡核苷酸單鏈probe I與PAA-GdF3：Tb3+納米粒子偶聯(lián) 寡核苷酸單鏈probe I的5’端帶有氨基，GdF3：Tb3+納米粒子表面有大量羧基，可以通過EDC和NHS催化于水相中實(shí)現(xiàn)氨基和羧基的縮合[10]。將步驟1.3.1所得粉末配制成5%w/v水溶液，取100 μL上述水溶液、5 nmol寡核苷酸單鏈probe I（5′-NH2-（CH2）6-TGGAGTGTG AC-3′）、30 mg EDC、5 mg NHS加入到1 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）中，混合均勻后室溫下電磁攪拌反應(yīng)24 h。產(chǎn)物以2 000 r/ min離心5 min后以PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）洗滌2次，并于PBS（10 mmol/L，pH 7.4，100 mmol/L NaCl）中4°C儲(chǔ)存，此溶液為偶聯(lián)有寡核苷酸單鏈probe I的GdF3：Tb3+納米粒子溶液。

1.3.3 制備寡核苷酸單鏈probeⅡ修飾的金納米粒子 參考文獻(xiàn)方法[11]，利用檸檬酸鈉還原HAuCl4制備新鮮的膠體金納米粒子溶液并將寡核苷酸單鏈probeⅡ（5′-AATGGTGTTTG-（CH2）6-SH-3′）與金納米粒子偶聯(lián)，最后將其分散于PBS（10 mmol/L，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2）的緩沖溶液中，儲(chǔ)存于4°C備用。

1.3.4 FRET傳感器構(gòu)建 參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)條件[12]，通過核酸雜交反應(yīng)偶聯(lián)上述兩種納米粒子。取100 μL偶聯(lián)有寡核苷酸單鏈probeⅠ的GdF3：Tb3+納米粒子溶液，加入200 μL寡核苷酸單鏈probeⅡ修飾的金納米粒子溶液和5 nmol probeⅢ（5′-CAAACACC ATTGTCACACTCCA-3′），37°C、3 000 r/min振蕩約1 h，以熒光光度計(jì)監(jiān)測(cè)543 nm處的熒光變化直至降低至不再變化。2 000 r/min離心5 min，小心棄去上清液，以PBS（10 mmol/L，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2）洗滌，再重復(fù)兩次上述離心和洗滌過程以去除未結(jié)合的probeⅢ和金納米粒子，得到FRET傳感器的PBS溶液。

1.3.5 檢測(cè)原理 圖1顯示了本傳感器的工作原理如下：以寡核苷酸單鏈probeⅠ偶聯(lián)GdF3：Tb3+納米粒子作為FRET供體，以寡核苷酸單鏈probeⅡ偶聯(lián)金（Au）納米粒子作為FRET受體，先利用probeⅢ與probeⅠ和Ⅱ的堿基互補(bǔ)作用將供體與受體連接并建立高效的FRET，使GdF3：Tb3+納米粒子熒光淬滅，此混合體系即為檢測(cè)混合液。以hsamiR-122-5p為模式目標(biāo)分子，當(dāng)向上述檢測(cè)混合液中加入含有目標(biāo)RNA的待測(cè)樣本后，probeⅢ與目標(biāo)RNA結(jié)合，原有的FRET被打破，GdF3：Tb3+納米粒子熒光恢復(fù)，即實(shí)現(xiàn)off-on檢測(cè)模式。通過設(shè)置多功能酶標(biāo)儀的檢測(cè)模式為 time-resolve spectra，延遲時(shí)間為100 μs、門時(shí)間為1 ms，去除短壽命的自發(fā)熒光背景，檢測(cè)GdF3：Tb3+納米粒子在543 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算樣本中目標(biāo)分子濃度。表1中列出了實(shí)驗(yàn)所涉及核酸序列，其中5p-1x、5p-1y及5p-1z均為目標(biāo)miRNA hsa-miR-122-5p的單堿基差異核酸序列。

圖1 基于鑭系金屬摻雜納米粒子的時(shí)間分辨FRET生物傳感器用于has-miR-122的無擴(kuò)增檢測(cè)原理示意圖Fig 1 Schematic diagram of the direct non-amplification detection ofmiRNAsbytime-resolvedFRETassaybasedonlanthanidedopednanocrystals

1.3.6 樣品準(zhǔn)備 （a）用于TR-FRET檢測(cè)的血清處理[13]：實(shí)驗(yàn)前，1.0 mL血清樣本中加入100 μL 100 mg/mL酵母tRNA以保護(hù)內(nèi)源miRNAs不被核酶降解。以PBS（25 mmol/L，pH 7.0，25 mmol/L NaCl）將血清樣本稀釋 10倍，95℃加熱 15 min以釋放miRNAs。在96孔板的樣品孔內(nèi)，加入90 μL人工合成hsa-miR-122-5p的PBS溶液或稀釋血清，再加入10 μL FRET傳感器，于室溫下震蕩孵育1 h后檢測(cè)。（b）陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)：以5.1 mg/mL人血清白蛋白代替血清，后續(xù)處理同上。（c）對(duì)照方法：qRT-PCR，利用RNA提取試劑盒提取血清全部RNA，并以qRT-PCR試劑盒檢測(cè)hsa-miR-122-5p。

1.3.7 光譜掃描條件 以272 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描400～700 nm的熒光發(fā)射光譜；以543 nm作為發(fā)射波長(zhǎng)，掃描220～400 nm的熒光激發(fā)光譜。TRFL（時(shí)間分辨熒光）分析測(cè)試：以272 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定543 nm處的熒光，延遲時(shí)間（delay time）為100 μs，檢測(cè)門時(shí)間（gate time）為1 ms。

2 結(jié)果

2.1 PAA-GdF3：Tb3+納米粒子的熒光性質(zhì) 本工作通過一步溶劑熱法制備了PAA-GdF3：Tb3+納米粒子。使用分子量為2 000的PAA作為表面封端劑以控制粒子生長(zhǎng)，并藉此賦予納米粒子水溶性及生物相容性。本工作中所合成的PAA-GdF3：Tb3+納米粒子易溶于水，水溶液澄清透明。該納米粒子在水溶液、300 mmol/L NaCl溶液及pH 5.0～12.0磷酸鹽緩沖液中，在室溫下、空氣中、不避光保存1個(gè)月，既沒有發(fā)生絮凝也沒有沉淀，說明此納米粒子可以耐受多種生理?xiàng)l件。

圖2a為PAA-GdF3：Tb3+納米粒子水溶液的熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜。該納米粒子在272 nm處有尖銳激發(fā)線，對(duì)應(yīng)Gd3+離子向的躍遷，相比之下Tb3+的激發(fā)線非常微弱。在543 nm處有最大熒光發(fā)射，對(duì)應(yīng)Tb3+離子5D4向7F5的特征躍遷發(fā)射，紫外燈照射下該溶液發(fā)射綠色熒光（圖2a）。上述結(jié)果說明，GdF3：Tb3+納米粒子主體Gd3+吸收光子，并向摻雜Tb3+轉(zhuǎn)移能量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)摻雜元素Tb3+的熒光發(fā)射。本工作檢測(cè)了PAA-GdF3：Tb3+納米粒子水溶液在543 nm的熒光衰減曲線（圖2b），經(jīng)擬合該熒光衰減曲線符合雙指數(shù)函數(shù)，所制備納米粒子的平均熒光壽命為1.2 ms，此熒光壽命遠(yuǎn)大于生物樣本自發(fā)熒光壽命，足以利用時(shí)間分辨技術(shù)扣除短壽命熒光背景干擾。金納米粒子在400 nm到600 nm范圍內(nèi)有廣泛吸收，與PAA-GdF3：Tb3+納米粒子的發(fā)射光譜有較好的交疊，表明二者之間有實(shí)現(xiàn)FRET的條件。

圖2 PAA-GdF3：Tb3+納米粒子水溶液的熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光衰減曲線Fig 2 Excitation spectra,emission spectra and decay curve of the as-prepared PAA-GdF3：Tb3+nanocrystals solution

2.2 線性范圍及特異性 向檢測(cè)混合液中加入人工合成目標(biāo)miRNA hsa-miR-122-5p，檢測(cè)混合液在543 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生了有規(guī)律的增加。在0.1 fmol/L～100 pmol/L濃度范圍內(nèi)，所加入miRNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)（-logCmiRNA）與檢測(cè)混合液的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，并且相關(guān)系數(shù)r2＞0.99（圖3）。

圖3 目標(biāo)miRNA hsa-miR-122-5p對(duì)檢測(cè)混合液熒光強(qiáng)度（543 nm）的影響Fig 3 Effect of target miRNA hsa-miR-122-5p on the fluorescence intensity at 543 nm of detecting mixture

由于miRNA家族成員之間具有高度的序列相似性，因此，本工作還考察了檢測(cè)體系的特異性，包括對(duì)單堿基差異的識(shí)別能力和前體miRNA的交叉雜交（圖4a），各寡核苷酸鏈的堿基序列見表1。向檢測(cè)混合液中分別加入目標(biāo)miRNA hsa-miR-122-5p及其單堿基差異核酸序列5p-1x、5p-1y及5p-1z各200 pmol/L，檢測(cè)混合液在543 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度均有增加，但單堿基差異類似物與probeⅢ交叉雜交所引起的信號(hào)變化不足20%，其中5p-1y引起的交叉雜交最大，為18.2%。前體miRNA是一種含有成熟miRNA序列的穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)RNA，也可能會(huì)對(duì)成熟miRNAs檢測(cè)產(chǎn)生一定的干擾，因此，本工作中對(duì)pre-hsa-miR-122-5p的干擾做了進(jìn)一步考察。200 pmol/L pre-hsa-miR-122-5p產(chǎn)生的信號(hào)與hsa-miR-122-5p相比為10.2%。以上結(jié)果說明本方法不僅能夠區(qū)分單堿基差異序列，而且能夠有效區(qū)分成熟miRNAs與其前體miRNAs。

圖4 miRNA熒光傳感器對(duì)不同樣本的時(shí)間分辨熒光信號(hào)響應(yīng)Fig 4 TR-fluorescence response of miRNA sensor to different samples

2.3 血清內(nèi)源hsa-miR-122檢測(cè) 將本文所開發(fā)的熒光傳感器應(yīng)用于人血清內(nèi)源hsa-miR-122的檢測(cè)。圖4b顯示，CCL患者血清內(nèi)源hsa-miR-122稍多于健康人，與qRT-PCR分析結(jié)果一致。以上試驗(yàn)說明：本傳感器能夠從血清背景中成功檢出目標(biāo)miRNAs的豐度。

3 討論

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是在熒光供體的激發(fā)狀態(tài)下由一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量從供體向受體轉(zhuǎn)移的非輻射過程[14]。FRET受體和供體之間依靠生物偶聯(lián)作用相結(jié)合時(shí)，彼此間距只有幾個(gè)納米，二者之間的能量轉(zhuǎn)移過程可以通過掃描供體和受體的熒光光譜得以檢測(cè)[15-16]。FRET效率對(duì)因目標(biāo)分子濃度變化引起的受體-供體間距在納米尺度的差異具有優(yōu)越的靈敏度，因此，近年來在生物分析領(lǐng)域，尤其是在核酸雜交的檢測(cè)中，F(xiàn)RET技術(shù)發(fā)揮了巨大的作用。然而，目前FRET技術(shù)普遍應(yīng)用的有機(jī)小分子熒光供體光漂白嚴(yán)重；而且，基于穩(wěn)態(tài)熒光的傳統(tǒng)FRET分析中，當(dāng)以紫外光激發(fā)時(shí)，生物樣本的自發(fā)熒光干擾十分嚴(yán)重[15,17]。

稀土摻雜納米粒子是一類新興的熒光傳感器材料，與有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，稀土摻雜納米粒子有很多更優(yōu)越的化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，例如：生物毒性低、有效Stokes位移大、發(fā)射峰狹窄、熒光壽命長(zhǎng)以及耐光漂白能力強(qiáng)。由于稀土摻雜納米粒子適用于時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)，因此，有望將此材料應(yīng)用于非侵襲性、無損傷的實(shí)時(shí)在體疾病監(jiān)測(cè)[18-19]。

本工作以寡核苷酸單鏈probeⅠ偶聯(lián)GdF3：Tb3+納米粒子作為FRET供體，以寡核苷酸單鏈probeⅡ偶聯(lián)金納米粒子作為FRET受體，以hsa-miR-122-5p為模式目標(biāo)分子，通過設(shè)置多功能酶標(biāo)儀的檢測(cè)延遲去除自發(fā)熒光背景，利用供體與受體之間的FRET檢測(cè)樣本中目標(biāo)分子濃度。該傳感器能夠高靈敏度、高特異性地檢測(cè)目標(biāo)分子，并且對(duì)于光照有良好的耐受性，能夠避免自發(fā)熒光干擾。對(duì)hsa-miR-122-5p的檢測(cè)線性范圍為0.1 fmol/L～100 pmol/L，與同類型的RNA熒光傳感器的檢測(cè)限具有可比性。將該傳感器應(yīng)用于血清內(nèi)源hsa-miR-122檢測(cè)時(shí)，能夠有效檢出樣本中目標(biāo)物的豐度差異。

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（2015-08-06收稿）

Direct non-amplification detection of miRNAs by time-resolved FRET sensor based on lanthanide-doped
nanocrystals

ZHANG Yi,TAN Jia-xing,YE Yan-kai,JIANG Wei,SUN Yan-hua,SHEN Wan-qiu,CAO Hai-yan,JIN Mei-na,QIN Nan,DUAN Hong-quan（Department of Medical Chemistry,College of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics（Theranostics）,Tianjin 300070,China）

Objective：To develop a miRNA detection method based on the time-resolved（TR）fluorescence resonance energy transfer（FRET）assay.Methods：The GdF3：Tb3+nanocrystals were coupled with nucleotide probe I as donor,and gold nanocrystals with nucleotide probeⅡas acceptor.miRNA hsa-miR-122-5p was detected by time-resolved FRET assay,and the short lived background luminescence such as auto-fluorescence was suppressed when determining the long lived fluorescence of Tb3+by setting appropriate delay time and gate time.Results：The TR-FRET based miRNA sensor was sensitive and selective to hsa-miR-122-5p with a dynamic linear range of 0.1 fmol/ L-100 pmol/L,which was compatible with that of the same type of sensors.Furthermore,the GdF3：Tb3+nanocrystals were stable to light irradiation and their lifetime was long enough to avoid autofluorescence.Conclusion：The TR-FRET miRNA sensor for non-amplification detection of hsa-miR-122-5p based on GdF3：Tb3+nanocrystals,is sensitive and selective.

lanthanide-doped;nanocrystals;time-resolved;fluorescence resonance energy transfer;miRNA;sensor;non-amplification detection

R9

A

1006－8147（2015）06-0521-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21305103，21373151，31200753，21205087）

張毅（1982-），女，博士，研究方向：納米材料于生化分析的應(yīng)用；通信作者：段宏泉，E-mail:duanhq@tijmu.edu.cn。