趙靜　吳慧　翁迎峰

(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上?！?01100)

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·論著·

腦源性神經(jīng)生長因子的基因多態(tài)性與中國漢族人群缺血性卒中90天預(yù)后的相關(guān)性研究

趙靜吳慧翁迎峰

(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海201100)

摘要目的：探討中國漢族人群中腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)基因的單核苷酸多態(tài)性與缺血性卒中(ischemic stroke，IS)的關(guān)系。方法： 采用聚合酶鏈式反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)在494例IS患者(IS組)和337例健康對照者(對照組)中檢測BDNF基因G196A位點的單核苷酸多態(tài)性，計算等位基因的頻率分布。IS組在入院當天依據(jù)神經(jīng)功能缺損評分(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評估神經(jīng)功能缺損程度，腦梗死后3個月隨訪時根據(jù)改良Rankin評分標準(modified Rankin Scale，mRS)評估患者的神經(jīng)功能恢復(fù)情況。結(jié)果：IS組BDNF基因G196A位點AA基因型的頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。IS組中輕癥和重癥患者在BDNF 基因G196A位點的基因型和等位基因頻率分布上無顯著差異(P=0.800)。但出院后90 d的隨訪結(jié)果顯示，BDNF基因G196A位點AA基因型患者較GG基因型患者預(yù)后不良的相對風(fēng)險度為1.406[P=0.008，比值比(OR)=0.406，95%可信區(qū)間(95%CI)：1.203~1.813]；采用Logistic回歸方法對其他危險因素進行校正后，這種相關(guān)性仍然存在(P=0.012，OR=2.134,95%CI：1.178~3.866)。結(jié)論：BDNF基因G196A位點多態(tài)性與中國漢族人群IS急性期神經(jīng)功能缺損程度可能無關(guān), BDNF基因G196A位點呈GA+AA基因型的IS患者預(yù)后更差， A等位基因可能是預(yù)測中國漢族人群IS預(yù)后不良的獨立生物學(xué)指標。

關(guān)鍵詞腦源性神經(jīng)生長因子；單核苷酸多態(tài)性；缺血性卒中；預(yù)后

卒中的病死率、病殘率很高，即使在卒中幸存者中，仍有約75%的患者有不同程度的勞動力喪失[1]。缺血性卒中(ischemic stroke，IS)約占全部卒中的43%~79%[2]。臨床發(fā)現(xiàn)，IS患者中不同個體的梗死部位、面積幾近相同，但臨床癥狀的嚴重程度及遠期功能恢復(fù)卻不盡相同。這提示，某些遺傳因素可能在腦組織的可塑性上起了重要作用。

研究[3]發(fā)現(xiàn)，無論短暫性還是持續(xù)性腦缺血，都會誘導(dǎo)內(nèi)源性腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達增加，這可能是機體的一種內(nèi)源性自我保護機制。BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的一種蛋白質(zhì)，對神經(jīng)元的存活、分化、生長均起重要作用，是維持中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元生存和正常生理功能所必需。BDNF功能編碼區(qū)內(nèi)的G196A位點突變可能影響B(tài)DNF蛋白在細胞內(nèi)的加工及分泌過程，進而影響腦的結(jié)構(gòu)和功能-[4-5]。最近的研究顯示，BDNF多態(tài)性與動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者及外傷性腦損傷患者的預(yù)后相關(guān)[6-7]，還可能與可逆性腦血管收縮綜合征(RCVS)患者的神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)[8]。然而，目前有關(guān)BDNF多態(tài)性與卒中遠期預(yù)后的相關(guān)性研究卻極少。本研究用病例對照的方法, 采用聚合酶鏈式反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)(polymerase chain reaction-ligase detection reaction,PCR-LDR)技術(shù)探討漢族人群中BDNF基因G196A位點的多態(tài)性與IS的急性期神經(jīng)功能缺損嚴重程度及90天預(yù)后之間的相關(guān)性，以期為IS的急性及慢性期的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料2008年9月—2012年5月在上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性IS患者494例(IS組)，均符合WHO缺血性卒中的診斷標準，均為首次發(fā)生卒中或曾經(jīng)發(fā)生卒中但無后遺癥的患者，均完成心電圖、頸部血管彩超及頭顱MRl檢查。對照組選自同期的337名健康體檢者。兩組的年齡及性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0．05)。所有研究對象間均無血緣關(guān)系，均為漢族。排除標準 ：既往有嚴重心、肝、腎功能不全及其他嚴重基礎(chǔ)疾?。槐敬巫渲星盎加羞\動功能受限的嚴重身體疾病;合并癡呆、帕金森病、腦腫瘤、癲癇、精神病或有酗酒和藥物依賴。

IS組的494例患者按急性卒中Org 10172治療試驗(the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment,TOAST)分型分為大動脈粥樣硬化性卒中(large-artery atherosclerosis,LAA)、心源性腦栓塞(cardioembolism,CE)、小動脈閉塞性卒中(small-artery occlusion Lacunar,SAO)或腔隙性卒中(SAA)、其他原因所致的IS(acute stroke of other determined etiology,SOE)、不明原因的IS(stroke of other undeterminedetiology,SUE)。

1.2神經(jīng)功能缺損程度以及日常生活能力評定

1.2.1神經(jīng)功能缺損程度評定在患者入院當天，由兩名經(jīng)過培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師根據(jù)NIHSS[9]評分標準對神經(jīng)功能缺損程度進行評分，≥7分為嚴重 ，≤6分為輕型。

1.2.2日常生活能力評定 由于卒中后3個月時神經(jīng)元的修復(fù)達高峰，故對患者進行90 d的回訪。由兩名經(jīng)過培訓(xùn)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師依據(jù)改良Rankin評分標準(modified Rankin Scale，mRS)[10]評定患者的日常生活能力。0~1分為良好，表明無或僅有輕微殘疾，但不影響日常生活；≥2分為差，表明影響日常生活能力。

1.3實驗方法

1.3.1標本采集所有被檢者禁食 12～14 h，晨起測血壓并采空腹靜脈血5 mL。在采集后1 h內(nèi)離心，分離血細胞。

1.3.2基因組DNA的提取及PCR取血細胞200 μL，嚴格按UNIQ-10柱式臨床樣品基因組抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)說明書提取基因組DNA。PCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，上游引物: 5′ACTCTGGAGAGCGTGAATGGG 3′，下游引物: 5′AGAAGAGGAGGCTCCAAAGG 3′。BDNF基因PCR擴增體系為20 μL，其中DNA 1 μL，10×buffer 2 μL，MgCl2(3 mM) 0.6 μL，dNTP (2 mM) 2 μL，Primer F(10 pmoL/μL) 0.2 μL，Primer R(10 pmoL/μL) 0.2 μL，Taq酶(1 U/μL) 0.3 μL，H2O補至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取 2 μL反應(yīng)產(chǎn)物，用3.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察PCR 是否成功(圖 1)，將剩余PCR產(chǎn)物保存于-20℃。

1.3.3LDR設(shè)計分別用于識別兩種不同堿基的左端探針和帶熒光的右端共用探針，其終產(chǎn)物的長度差別即為左端探針的差別，探針序列見表1。

圖1　PCR 電泳圖

LDR的反應(yīng)體系： PCR產(chǎn)物(100 ng/μL)1 μL，10×Buffer 1 μL，連接酶2U，探針(12.5 pmoL/μL) 1 μL，補H2O至10 μL。

LDR反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)2 min，94℃反應(yīng)15 s，

50℃反應(yīng)25 s，循環(huán)30次。

取LDR連接液1~2 μL，加入10 μL Hidi、0.1 μL Liz500，充分混勻并置于PCR儀中，98℃變性5 min后立即將96孔板置于冰水混合物上冷卻，并用3730序列分析儀( 美國 ABI 公司)進行檢測。在含5 moL/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝膠中進行毛細管電泳(電壓為3000 V)，電泳2.5 h。采用Gene ScanTM672軟件收集數(shù)據(jù)、測量遷移片段大小、校正泳道線和內(nèi)在分子量標準。采用Genemapper軟件進行數(shù)據(jù)分析，分析各SNP位點的基因分型。隨機選取BDNF基因G196A位點的野生型、雜合子、突變純合子PCR產(chǎn)物各2例，用上海生工生物工程股份有限公司合成的引物直接測序驗證。

表1　LDR探針序列

2結(jié)果

2.1IS組和對照組的一般資料比較IS組和對照組的一般資料比較見表2。IS組494例患者的年齡為40~85歲，平均年齡(69.75±11.32)歲；其中男性283例，女性211例。對照組共337例，年齡40~85歲，平均年齡(69.75±11.32)歲；其中男性186例，女性151例。兩組在年齡(P=0.303)和性別(P=0.550)方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。常見的卒中危險因素中，IS組包括高血壓374例(75.7%)、糖尿病68例(34.0%)、高膽固醇血癥164例(33.2%)，吸煙202例(40.9%)；對照組包括高血壓205例(60.8%)、糖尿病56例(16.6%)、高膽固醇血癥80例(23.7%)、吸煙91例(27.0%)。IS組中以上各危險因素的比例均明顯高于對照組。進一步對IS組患者進行TOAST分型：LAA患者200例，其中男性109例、女性91例，平均年齡(70.03±10.72)歲；SAO患者165例，其中男性101例、女性64例，平均年齡(68.39±10.78)歲；CE患者82例，其中男性42例、女性40例，平均年齡(70.99±13.09)歲。TOAST分型各亞型患者與對照組相比，在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2G196A位點的基因分型采用Genemapper軟件分析STR(short tandem repeat)數(shù)據(jù)，G196A位點的3種基因型GG、AG和AA的分型截圖見圖2。

2.3SNP位點的PCR引物序列及測序圖用引物對各SNP位點的PCR產(chǎn)物進行序列分析驗證，結(jié)果見圖3。

2.4IS組與對照組BDNF基因G196A位點的基因型比較IS組的BDNF基因G196A位點AA基因型頻率高于對照組，AA基因型人群較GG基因型人群發(fā)生IS的相對風(fēng)險度為1.541[P=0.021，比值比(OR)=1.541，95%可信區(qū)間(95%CI)：1.034~2.298)]。AA基因型人群較GG+GA基因型人群發(fā)生IS的相對風(fēng)險度為1.409(P=0.026，OR=1.409， 95%CI：1.008~1.970)。見表3。

2.5IS組BDNF基因G196A位點的基因型與神經(jīng)功能缺損嚴重度的關(guān)聯(lián)在入院當天依據(jù)NIHSS評分標準對IS組患者的神經(jīng)功能缺損程度進行評分，輕型382例，重型112例。BDNF基因G196位點的A基因型頻率和等位基因頻率分布在輕、重型患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表2　IS組和對照組的一般資料比較　(n,%)

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2 G196A位點的基因型GG、AG和AA型

圖3　PCR產(chǎn)物的序列驗證

2.6IS組BDNF基因G196A位點的基因型與90 d預(yù)后的關(guān)聯(lián)對知情同意參加隨訪研究的308例腦梗死患者進行90 d隨訪，依據(jù)mRS評分標準進行日常生活能力評分。0~1分為轉(zhuǎn)歸良好 (n=193)， 2分及以上為預(yù)后差(n=115)。結(jié)果顯示，BDNF基因G196A位點AA基因型患者較GG基因型患者發(fā)生預(yù)后不良的相對風(fēng)險度為1.406(P=0.008，OR=1.406，95%CI：1.203~1.813)。BDNF基因G196A位點GA基因型患者較GG基因型患者發(fā)生預(yù)后不良的相對風(fēng)險度為1.546(P=0.034，OR=1.546，95%CI：1.296~2.000)。AA+GA基因型患者較GG基因型患者發(fā)生預(yù)后不良的相對風(fēng)險度為2.014(P=0.011，OR=2.014，95%CI：1.124~3.607)。見表5。

2.7IS患者90天預(yù)后的多因素分析采用二分類反應(yīng)變量的回歸模型(SPSS 19.0軟件包Logistic回歸模型)分析年齡(75歲分界)、性別、糖尿病、高血壓、高脂血癥、吸煙史等危險因素，計算各自的OR值及其95%CI，同時篩選出獨立危險因素。結(jié)果顯示，除高齡是IS患者90天預(yù)后不良的獨立危險因素外，BDNF基因G196A位點的A等位基因也是IS患者90天預(yù)后不佳的獨立危險因素(P=0.012，OR=2.134, 95%CI:1.178~3.866)，攜帶A等位基因的IS患者較攜帶G等位基因的IS患者不良預(yù)后的相對風(fēng)險度為2.134。見表6。

表3　IS組與對照組BDNF基因G196A位點基因型頻率的比較　(n,%)

表4　IS組BDNF基因G196A位點基因型頻率與神經(jīng)功能缺損嚴重度的關(guān)聯(lián)　(n，%)

表 5　BDNF基因G196A位點基因型頻率與缺血性卒中90天預(yù)后的關(guān)聯(lián)　(n,%)

注：*P<0.05

表 6　BDNF基因G196A位點基因型與缺血性卒中90天預(yù)后的Logistic回歸校正結(jié)果

注：*P<0.05

4討論

目前，IS的治療效果仍不盡人意。如何預(yù)防及減少卒中后的殘疾率已成為普遍關(guān)注的問題。遺傳變異可能影響個體對于卒中后治療模式的反應(yīng)。

BDNF是腦發(fā)育過程中最豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，它在調(diào)控神經(jīng)元的存活、增強突觸傳遞以及促進神經(jīng)可塑性方面起著至關(guān)重要的作用[11]。BDNF能刺激胞體發(fā)出突起并使突起延伸，刺激軸突和樹突出芽，還可以使神經(jīng)遞質(zhì)經(jīng)胞體順行運輸至軸突末端、釋放并被次級神經(jīng)元攝取和利用，增強突觸間遞質(zhì)的釋放和信號傳遞，參與突觸可塑性。因此，BDNF是在神經(jīng)元受到損傷和發(fā)生病變時促使其存活和再生的必需因子[12]。

本研究采用PCR-LDR方法分析了494例IS患者和337例健康對照者中BDNF 基因G196A位點的基因多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IS組BDNF基因G196A位點AA基因型的頻率高于對照組，AA基因型人群發(fā)生IS的風(fēng)險是GG基因型人群的1.541倍 (P=0.021，OR=1.541，95%CI：1.034~2.298)。我們還對患者入院當天的神經(jīng)功能缺損程度與基因型進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果未見顯著差異(P=0.800)。出院后90 d的隨訪顯示，BDNF基因G196A位點AA+GA基因型患者發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險是GG基因型患者的2.014倍；采用Logistic回歸方法對其他可能影響IS患者預(yù)后的危險因素(年齡、高血壓、糖尿病、吸煙)進行校正后，這種相關(guān)性仍然存在 (P=0.012，OR=2.134，95%CI：1.178~3.866)；提示 BDNF基因G196A位點的A等位基因是預(yù)測IS預(yù)后不良的獨立生物學(xué)指標。

BDNF分子單體共有119個氨基酸殘基，是由β折疊和無規(guī)則卷曲二級結(jié)構(gòu)組成的堿性蛋白質(zhì)，等電點為9.99，相對分子質(zhì)量為3.5103。有證據(jù)顯示, BDNF等位基因變異小鼠在卒中后，其運動功能受損和血管生成減少更為明顯[13]。Barbey等[14]發(fā)現(xiàn)，BDNF基因vaL66met多態(tài)性與老年腦血管病的認知功能無關(guān)，但與外傷性腦損傷后認知功能改變有關(guān)。臨床研究[15]發(fā)現(xiàn)，BDNF 基因VaL66Met多態(tài)性與未破裂腦動脈畸形的預(yù)后有關(guān)，但是不影響外傷后植物狀態(tài)的預(yù)后[16]。 目前，關(guān)于BDNF基因vaL66met多態(tài)性與卒中預(yù)后的關(guān)聯(lián)仍不確定，且尚少見對卒中慢性階段的IS患者的功能恢復(fù)與BDNF基因 vaL66met多態(tài)性的相關(guān)性分析[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，BDNF 基因C270T位點的多態(tài)性與卒中亞型有關(guān)；BDNF基因 G196A位點可能與出血性卒中的早期神經(jīng)功能缺損程度有關(guān)，而與30 d預(yù)后無關(guān)；但這種基因型效應(yīng)并不存在于并發(fā)腦梗死的病例中。對韓國人群的研究[19]發(fā)現(xiàn)，BDNF基因 G196A位點的多態(tài)性與卒中的早期神經(jīng)功能缺損程度以及90天預(yù)后相關(guān)。我們的部分結(jié)果與韓國人群的結(jié)果一致，但與西方人群中的研究結(jié)果不一致，后者認為BDNFG196A位點 A等位基因與IS的預(yù)后無關(guān)[20]，這種差異可能與病例數(shù)、人種、遺傳素質(zhì)、飲食習(xí)慣、地理環(huán)境、人的生長狀態(tài)以及檢測方法等有關(guān)。

據(jù)我們檢索文獻得知，本研究是對中國漢族人群BDNF 基因G196A位點多態(tài)性和IS預(yù)后之間的關(guān)系的首次報道。但需要特別注意的是，卒中是一種由遺傳和環(huán)境等多種因素共同引發(fā)的疾病，眾多復(fù)雜因素的累積與疊加抑或抵消與減弱，均可能對卒中的發(fā)生以及預(yù)后產(chǎn)生不同程度的影響。本研究也有一些局限性，例如樣本量小，病例來自局部地區(qū)，隨訪時間不夠長。今后擬擴大樣本量開展多中心、多區(qū)域合作并進行長期隨訪，以期得出更有說服力的結(jié)論。

致謝：本研究項目獲得上海市閔行區(qū)人才發(fā)展專項資金資助。

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Study of Correlation between Genetic Polymorphism of Brain-Derived Neurotrophic Factor and 90-day Outcome of Ischemic Stroke in Chinese Han Population

ZHAOJingWUHuiWENGYingfengDepartmentofNeurology,MinhangDistrictCentralHospital,Shanghai201100,China

AbstractObjective：To investigate the correlation between single nucleotide polymorphism(SNP) of BDNF gene and ischemic stroke(IS). Methods:The SNP of BDNF gene G196A in 494 patients with IS(IS group) and 337 healthy controls(control group) was detected by polymerase chain reaction-ligase detection reaction (PCR-LDR) assay, and the allele frequency was calculated. The degree of neural function defect in IS group was assessed at the admission day with the National Institutes of Health Stroke Severity Scale (NIHSS). On post-infarction 3-month follow-up, the neural function recovery of patients was assessed with the modified Rankin Scale (mRS). Results: The frequency of genotype AA at BDNF gene G196A in IS group was higher than that in control group, and the difference was statistically significant(P<0.05). There was no significant difference with regard to the genotype at BDNF gene G196A and the allele frequency between the mild patients and the severe patients(P=0.800)．According to the outcomes on post-discharge 90-day follow-up, the relative risk of poor outcome in patients with genotype AA at BDNF gene G196A to that in patients with genotype GG at BDNF gene G196A was 0.046 (P=0.008，OR=0.406，95%CI：203-0.813). After the other risk factors had been adjusted with logistic regression method, the correlation was still significant(P=0.012,OR=2.134，95%CI: 1.178-3.866). Conclusions: Perhaps there was no association between the polymorphism of BDNF gene G196A and the severity of neural function defect during acute phase of IS in Chinese Han population. The presence of genotype GA+AA at BDNF gene G196A was associated with much poorer outcome in patients with IS. Allele A might be the independent bioindicator of poor outcome of IS in Chinese Han population.

Key WordsBrain-derived neurotrophic factor；Single nucleotide polymorphism；Ischemic stroke；Outcome

基金項目：上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會2012年基金項目(編號：20124266)

中圖分類號R 743

文獻標識碼A