靶向超聲造影劑在干細胞移植中的研究進展

香麗萍，穆玉明

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 83001l)

·綜 述·

靶向超聲造影劑在干細胞移植中的研究進展

香麗萍，穆玉明

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 83001l)

近年來，干細胞移植技術(shù)在心肌梗死的治療中應(yīng)用越來越廣泛。實驗研究發(fā)現(xiàn)，靶向超聲微泡技術(shù)能夠有效增強心肌梗死區(qū)域局部血管的通透性、提高該區(qū)域內(nèi)相關(guān)細胞因子的表達效率、增加梗死區(qū)新生血管的形成，從而促進干細胞靶向歸巢、改善心功能，提高干細胞移植的成功率。因此，本文通過整理總結(jié)相關(guān)資料，對將超聲聯(lián)合微泡技術(shù)應(yīng)用于干細胞移植治療急性心肌梗死過程中的研究進展做一綜述。

超聲微泡；干細胞移植；急性心肌梗死；靶向性

目前，諸多國內(nèi)外學者均對干細胞移植技術(shù)進行了研究，干細胞移植技術(shù)能夠把供體干細胞移植到損傷的心肌組織中，修復損傷壞死的心肌細胞，同時還能在局部積聚誘導血管新生。該技術(shù)為急性心肌梗死的有效治療指明了一個嶄新的方向[1]，但其效果會受到移植干細胞存活率、分化率以及靶向性等限制[2]。有研究表明，超聲造影劑中微氣泡可加強空化效應(yīng)，從而促進超聲生物效應(yīng)，利用超聲微介導術(shù)能夠提高移植干細胞存活率、分化率以及促進心肌梗死區(qū)域內(nèi)血管的新生，其主要機理在于超聲介導微泡空化效應(yīng)靶向傳輸。本文就靶向超聲造影劑的組成、理化特性、制備方式、靶向分子成像及聯(lián)合超聲微泡造影劑促進干細胞移植的研究進展綜述如下，為進一步研究靶向超聲造影劑在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用方面提供了理論基礎(chǔ)，使其能夠在干細胞移植技術(shù)治療心肌梗死的過程中發(fā)揮更積極的作用。

1 靶向超聲微泡造影劑的組成、理化特性和制備方式

靶向超聲造影劑是在超聲造影劑的表面連接上特異性配體，使其能夠自動和靶器官或靶組織上相應(yīng)的受體結(jié)合，并產(chǎn)生的特異性影像，在分子水平上直觀地反映出病變位置的變化。

1.1 靶向超聲造影劑的組成 超聲造影劑主要成分是微氣泡，一般直徑為2～10 um，由核心及外殼包膜構(gòu)成。其中，超聲造影劑微泡的核心可以是氟碳類的氣體，也可以是磷脂或者是氟烷類的液體；超聲造影劑微泡的外殼包膜則多為脂類、多聚體或者白蛋白。外殼包膜成分的區(qū)別造成超聲造影劑微泡的理化性質(zhì)也存在一定的差別[3]，主要有脂質(zhì)類外殼包膜和白蛋白及多聚體等構(gòu)成外殼包膜兩種，其中脂類化合物外殼包膜則較薄，僅有1～3 nm，因此脂質(zhì)類物質(zhì)制成的外殼包膜更容易進行靶向修飾，制備的靶向超聲造影劑具有偶聯(lián)配體的生物學活性，更有利于靶向超聲微泡技術(shù)的應(yīng)用，在國內(nèi)被廣泛使用。

特異性的靶向超聲造影劑作為一種理想的基因或藥物遞送載體，具有連接配體和其相應(yīng)的靶向組織的能力。超聲靶向分子成像就是利用這種特性將造影劑聚集在靶器官或者靶組織，然后利用超聲顯影技術(shù)在分子水平上呈現(xiàn)出靶器官或者靶組織的病理變化，最后實現(xiàn)特異性增強靶向區(qū)域信號以加強局部治療的作用。同時，靶向超聲造影劑和靶向微泡造影技術(shù)，通過介導微泡內(nèi)的藥物或基因，可以定位到病灶部位細胞表達的特異性抗原或受體上，達到靶向性定位治療的效果。

1.2 靶向微泡超聲造影劑的制備方法 靶向超聲造影劑外殼包膜與其特異性配體的連接方法主要有兩種：①非吸附性非共價鍵結(jié)合的免疫化學固定方法，該方法利用生物素-親和素系統(tǒng)較強的親和力，將生物素配體與超聲造影膜的外殼包膜連接在一起，將其生物素化，卻不改變其生物活性和生理特性，應(yīng)用較為廣泛的有親血栓性靶向超聲造影劑等；②直接化學連接法，首先需要將這類小分子配體與外殼包膜的分子進行結(jié)合(直接或間接結(jié)合)，之后通過使用普通造影劑的制作方法來獲得具有穩(wěn)定黏附配體的超聲造影劑。

2 UTMD改善干細胞微環(huán)境可能的原理

2.1 UTMD可以引起心肌梗死區(qū)的炎性反應(yīng) 最佳的心肌微環(huán)境可增加干細胞的分化、存活，但尚未明確，一般認為適度的炎性反應(yīng)可促進其干細胞歸巢。粘附分子及生長因子的表達有利于干細胞的黏附、增殖及分化；反之，過于強烈的炎性反應(yīng)不利于干細胞的存活。UTMD引起炎細胞聚集，IL-1等炎性因子的釋放，并且有利于干細胞向心肌內(nèi)移行；在血管內(nèi)皮受到損傷以后內(nèi)皮細胞粘附分子的表達增多，從而促使循環(huán)中的干細胞被黏附分子作用而更牢固的黏附在受損的血管內(nèi)皮上。Zhong等[4]觀察到UTMD處理組犬心肌組織VEGF、SDF-1、VCAM-1和lL-1b的表達比非治療犬明顯增高，表明UTMD可能通過改變?nèi)募∥h(huán)境促進MSCs歸巢。隨后的病理學結(jié)果表明，在1 MHz的頻率和1.0 W/cm2的強度下，UTMD能引起炎癥反應(yīng)，且僅有輕度心肌損傷。

2.2 UTMD可以改善局部微循環(huán) 心肌梗死后心臟重建尚包括新生血管和重建血運系統(tǒng)。在自然愈合的損傷區(qū)域，由循環(huán)骨髓衍生細胞生成的血管內(nèi)皮細胞無法再生出足夠的微血管網(wǎng)絡(luò)。因此提高局部血管生長因子濃度，促進治療性血管新生，恢復梗死區(qū)血供，是干細胞移植后能否存活的關(guān)鍵問題。血管生長因子包括VEGF、成纖維細胞生長因子(FGF)、HGF等。一定能量的超聲波輻照微泡后產(chǎn)生的輻射壓力可使移植的干細胞推向血管壁，并使之在局部積聚。聲致孔隙效應(yīng)通過增寬毛細血管內(nèi)皮細胞間隙，增加細胞膜的通透性，使外源性大分子進入組織間隙或細胞中來提高基因轉(zhuǎn)染效率及干細胞移植率，導致局部組織微血管破裂，提高內(nèi)源性血管生長因子分泌量，從而改善局部微循環(huán)。

3 超聲聯(lián)合微泡促進干細胞移植在心肌梗死區(qū)的歸巢

3.1 超聲聯(lián)合微泡提高局部血管通透性 超聲波的生物學效應(yīng)[5]是具有熱效應(yīng)、空化效應(yīng)和機械效應(yīng)等。增強空化效應(yīng)[6]是指通過外源性給予超聲微泡來增加空化核的數(shù)目、降低超聲的空化閾值來實現(xiàn)的。“空化核”是指液體中存在的微小氣泡?？栈?yīng)是指產(chǎn)生高溫、高壓、沖擊波來增寬內(nèi)皮細胞間隙、提高細胞膜的通透性，使細胞膜發(fā)生短暫性可逆的小孔，增加微泡破裂周圍組織生物屏障的通透性。通過相關(guān)分析，徐琢等[7]利用干細胞移植來進行豬急性心肌梗死的治療試驗中發(fā)現(xiàn)，利用超聲來對微泡的破壞進行傳導可以明顯的提高干細胞在心肌梗死區(qū)的靶向移植效率，提示超聲破壞微泡產(chǎn)生機械作用和空化效應(yīng)，使內(nèi)皮細胞收縮，內(nèi)皮間隙增寬，同時促使干細胞向梗死的心肌組織細胞進行遷移。此外，也有報道顯示，超聲介導微泡破壞對靶向血管的通透性有一定的影響，有利于干細胞的遷移，從而提高干細胞的移植效率。心臟功能的逐步完善也從另一方面證明了聲孔效應(yīng)的作用[8]。

3.2 超聲與微泡的刺激作用產(chǎn)生相關(guān)細胞因子，促進干細胞歸巢 當進行干細胞移植時，首先需要將干細胞通過靜脈注射的方式注入體內(nèi)，然后要增加干細胞在心臟梗死區(qū)域和周邊組織的聚集數(shù)量，從而提高治療的成功率。干細胞歸巢過程中重要的相關(guān)因子是趨化因子、生長因子及黏附分子等。趨化因子中基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)及其受體(CXCR4)的SDF-l/CXCR4軸是促進MSCs向損傷組織歸巢最重要的生物軸，組織損傷時局部受損組織SDF-l表達上調(diào)，使得表面表達CXCR4的MSCs向受損組織趨化歸巢[9]。而生長因子如肝細胞生長因子(HGF)及受體的HGF/c-met軸、干細胞因子(Stem cell factor，SCF)及受體的SCF/c-kit軸、粒細胞集落刺激因子、胰島素樣生長因子、血小板衍生因子(PDGF)等均與MSCs的歸巢相關(guān)。

Fujii等[10]通過超聲靶向微泡技術(shù)的使用來把VEGF和干細胞因子基因通過轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入試驗小鼠的梗死心肌細胞中，通過與對照組進行對比發(fā)現(xiàn)，實驗組小鼠的血管密度、蛋白表達和祖細胞的歸巢方面都有明顯的提高，同時對心肌灌注和心室功能的完善具有明顯的改善作用。此外，F(xiàn)ujii在[11]后續(xù)的研究中通過超聲輻照攜干細胞因子與基質(zhì)細胞衍生因子-1α基因的微泡造影劑來治療心肌缺血的實驗大鼠，在這項實驗當中，為了更顯著的研究治療效果特意增加了治療的過程并進行多次治療，在治療的過程中對心肌的損害進行研究。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在使用這兩種技術(shù)進行心肌缺血的治療過程中，對缺血心肌的血管密度有明顯的增加作用，從而進一步減小了心肌梗死的范圍，在試驗中發(fā)現(xiàn)，重復治療的次數(shù)達到6次是實驗大鼠的心肌血管密度達到最大，而心肌灌注功能與心室功能也隨著治療次數(shù)的增加而逐漸完善。

4 超聲結(jié)合微泡促進梗死區(qū)心肌血管新生

在近些年關(guān)于超聲微泡和干細胞移植的研究中發(fā)現(xiàn)，這兩者對血管的新生有很好的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，由超聲微泡作用所引起的的梗死區(qū)血管新生其作用機理主要是通過炎癥反應(yīng)來促進血管新生同時通過外源性基因的介導來實現(xiàn)血管的新生[12]。梗死區(qū)血管新生需要多種因子對其進行調(diào)控，是一個很復雜的過程。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)能促進血管新生的因子是VEGF、bFGF、HGF、表皮生長因子、白細胞介素-8、PDGF等[13]。Xu等[14]使用超聲輻照微泡造影劑來促進干細胞向試驗兔缺血心肌組織的遷移，通過與對照組進行對比發(fā)現(xiàn)，實驗組動物的心臟功能得以明顯的改善，心肌組織內(nèi)毛細血管數(shù)量明顯增多，心肌纖維化的范圍明顯減小。Yuan等[15]通過向?qū)嶒炄男呐K進行HGF質(zhì)粒與微泡造影劑的注射并聯(lián)合超聲輻照來促進基因的表達和血管的新生。Ghanem等[16]、Xu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在超聲聯(lián)合微泡干預后VEGF表達都升高。除VEGF外，有多項研究也成功的應(yīng)用超聲造影劑這種新型的基因轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)載bFGF[17]、HGF[18]及HIF-1α[19]等基因，然后將此類基因轉(zhuǎn)移到受損的心肌組織中，從而提高干細胞的轉(zhuǎn)染效率，以促進心肌細胞的再生，從而改善心肌缺血的情況。

5 目前存在的問題及展望

隨著超聲靶向破壞微泡技術(shù)在提高干細胞移植中的靶向歸巢、促進心功能改善和聯(lián)合基因中的應(yīng)用不斷發(fā)展與進步，同時也向我們提出了一些問題：(1)超聲輻照介導的微泡破壞可能引起一些不良反應(yīng)，如血管內(nèi)溶血、組織出血及器官損傷等，這些都與超聲的機械參數(shù)密切相關(guān)。(2)超聲介導微泡的靶向破壞雖然可以提高干細胞治療心肌梗死的移植率，但是在這一治療過程中，超聲參數(shù)的選擇和使用目前還沒有相對統(tǒng)一的結(jié)論。Vancraeynest等[20]在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，如果使用的超聲參數(shù)過高會導致試驗動物的左心室出現(xiàn)功能障礙，同時有短暫的ST段抬高從而導致心肌收縮帶的壞死。因此，微泡介導的相關(guān)超聲參數(shù)需要被大量、重復、系統(tǒng)地研究，以求將不良反應(yīng)降到最低而治療效果最佳。(3)超聲介導微泡破壞的時間窗：在急性的心肌梗死發(fā)生時，機體早期的炎癥反應(yīng)可以促使干細胞向梗死心肌組織遷移，但是有最佳的時間段，而目前的很多研究都沒有在這一研究中達到統(tǒng)一[21]。隨著新型超聲微泡的不斷發(fā)展，目前面臨的挑戰(zhàn)主要有：(1)通過對干細胞的特點進行分析來構(gòu)建專一性的靶向超聲微泡，從而在活體內(nèi)更好的追蹤干細胞，對于急性心肌梗死發(fā)生后的干細胞作用機制進行研究。(2)為了更好的提高干細胞移植的治療效果，構(gòu)建出活體內(nèi)大容量的特異性微泡。我們有理由相信，在醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展中，微泡的構(gòu)建技術(shù)與干細胞移植技術(shù)的不斷發(fā)展，多學科多領(lǐng)域的交叉融合和研究表明，靶向超聲微泡造影劑必將在干細胞移植治療急性心肌梗死的作用中發(fā)揮更大的優(yōu)勢，擁有更加廣闊的發(fā)展前景。

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Research development of targeted ultrasound contrast agent in stem cell transplantation.

XIANG Li-ping,MU Yu-ming.
Department of Cardiac Ultrasonography,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA

In recent years,stem cell transplantation technology is more and more widely applied in the treatment of myocardial infarction.Experimental studies have found that,targeted ultrasound microbubble technology can effectively enhance local vascular permeability,improve efficiency of relevant cytokines expression and increase for-mation of new blood vessels in myocardial infarction areas,and thereby promote stem cell targeting homing,improve cardiac function and increase success rate of stem cell transplantation.Therefore,this article makes a review on the research progress of application of ultrasound combined with microbubble technology in the process of stem cells transplantation in treatment of acute myocardial infarction.

Ultrasound microbubble;Stem cell transplantation;Acute myocardial infarction;Targeting

R458

A

1003—6350（2015）06—0843—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0301

2014-10-09)

國家自然科學基金（編號：81271590）

穆玉明。E-mail：mym1234@126.com