楊智，陳洪濤，吳詩品

肝細(xì)胞癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3 mRNA水平變化*

楊智，陳洪濤，吳詩品

作者單位：518020廣東省深圳市暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院感染內(nèi)科

第一作者：楊智，女，36歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。主要從事感染性疾病臨床與基礎(chǔ)研究。E-mail:ccyangzhi@sina.com

【摘要】目的檢測(cè)初發(fā)現(xiàn)未治療肝細(xì)胞癌（HCC）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中Foxp3 mRNA水平變化及其與血清AFP水平的關(guān)系。方法在HCC患者60例和健康人20例，采用RT-PCR法檢測(cè)PBMCs中Foxp3 mRNA水平，常規(guī)檢測(cè)血清AFP水平。結(jié)果HCC患者和健康對(duì)照組外周血Foxp3 mRNA水平分別為（0.976± 0.073）和（0.772±0.083），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，HCC患者外周血Foxp3 mRNA水平與AFP水平呈正相關(guān)（r＝0.226，P＝0.025）。結(jié)論HCC患者PBMCs中Foxp3水平明顯升高，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展可能具有一定的預(yù)測(cè)作用。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌；Foxp3；外周血單個(gè)核細(xì)胞；甲胎蛋白

在常見的惡性腫瘤中原發(fā)性肝癌全球排名第五,在常見死亡原因中排名第三[1]，每年大于60萬患者死于該病[2]。中國是肝癌的高發(fā)國家，在實(shí)體腫瘤中死亡率排第二位[3]。因其具有惡性度高、生長快、易復(fù)發(fā)和易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，早診斷早治療對(duì)患者預(yù)后的影響極大。因此，機(jī)體內(nèi)早期出現(xiàn)并具有高度特異性的血清學(xué)指標(biāo)對(duì)發(fā)生肝癌的預(yù)測(cè)并早期診斷尤為重要，且能作為監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的手段。目前，針對(duì)肝癌的血清學(xué)診斷應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物有甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白異質(zhì)體（Lectinreactive alpha-fetoprotein，AFP-L3）等。AFP的合成部位主要是在嚙齒動(dòng)物及人類胚胎的肝臟，但也可在卵黃囊及胃腸道。因此，生殖系統(tǒng)腫瘤及大量非癌癥肝病患者均可有AFP的升高，說明AFP的升高并非肝癌所特有，其診斷肝癌患者的陽性率僅為70%。鑒于AFP的這一非特異性表現(xiàn)，使其檢測(cè)對(duì)肝癌患者的早期診斷及術(shù)后復(fù)發(fā)的早發(fā)現(xiàn)存在不確定性。最近有報(bào)道指出，肝癌患者居高不下的術(shù)后復(fù)發(fā)率是導(dǎo)致患者難以長期生存的重要原因[4，5]。因此，我們急于尋找其它能早期提示肝癌發(fā)生的標(biāo)志物，以協(xié)同AFP檢測(cè)，提高肝癌的早期診斷率。腫瘤形成的基礎(chǔ)與機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境的改變和腫瘤細(xì)胞免疫逃逸能力增強(qiáng)有關(guān)。當(dāng)機(jī)體免疫力減弱，少量的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化后不能被有效地免疫殺傷，機(jī)體就可能會(huì)發(fā)生腫瘤。腫瘤患者免疫防御損傷及免疫功能在疾病的早期已經(jīng)開始發(fā)生變化，如能對(duì)腫瘤形成過程中有重要免疫調(diào)節(jié)作用的標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，可比AFP更早預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)生。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Tregs）為1995年Sakaguchi et al[6]首次報(bào)道的T細(xì)胞亞群,以表達(dá)CD4+和CD25+為表現(xiàn)型，能抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能，在維持免疫耐受中有重要作用。通過不同機(jī)理，Treg細(xì)胞可以抑制一系列免疫反應(yīng)，最后可以促使腫瘤細(xì)胞免疫耐受、逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的打擊。目前，國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明在肝細(xì)胞癌（HCC）患者外周血和腫瘤局部Treg細(xì)胞比例增加[7]，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要而不可忽視的免疫病理作用。Zhao HQ et al[8]對(duì)進(jìn)展期HCC患者Tregs細(xì)胞的作用進(jìn)行了Metal分析，這一研究篩選了23篇文獻(xiàn)，其中包括1279例HCC患者和547名健康人，結(jié)論顯示，Tregs參與HCC的發(fā)生，外周血循環(huán)和HCC組織中Tregs細(xì)胞均比健康對(duì)照組明顯升高，且與腫瘤大小及AFP水平呈正相關(guān)。另有研究亦發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞的多少與血清AFP水平呈正相關(guān)，提示Treg細(xì)胞聯(lián)合AFP檢測(cè)有可能成為肝癌術(shù)后隨訪的特異性指標(biāo)，對(duì)預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)及預(yù)后有參考價(jià)值[9]。而Foxp3只特異性地表達(dá)于CD4+CD25+Tregs細(xì)胞,是控制其發(fā)育及功能的關(guān)鍵基因。因此，可以將Foxp3作為鑒定CD4+CD25+Tregs細(xì)胞的一個(gè)特異性標(biāo)志物[10，11]。CD4+CD25+Tregs細(xì)胞亦高表達(dá)抑制性分子CTLA4和PD-L1，以及抑制性細(xì)胞因子IL-10 和TGF-β，其部分免疫抑制功能是通過這些分子發(fā)揮作用的，并且轉(zhuǎn)導(dǎo)Foxp3能使它們呈現(xiàn)高表達(dá)[12]。本研究通過對(duì)初發(fā)未治療HCC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中Foxp3和血清AFP水平的檢測(cè)，分析HCC患者與健康人Foxp3水平的差異，并分析其與血清AFP水平的相關(guān)性，以評(píng)估其對(duì)HCC發(fā)生的早期預(yù)測(cè)價(jià)值。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集60例原發(fā)性肝癌患者，均為初發(fā)未診治患者，來源于2013年1月至2014年10月我科住院患者，男52例，女8例；平均年齡47（27～78）歲。診斷符合2001年中國抗癌協(xié)會(huì)肝癌專業(yè)委員會(huì)修訂的肝癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：1.AFP≥400μg/L，影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變者，排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動(dòng)性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌；2.AFP＜400μg/L，排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動(dòng)性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并有兩種影像學(xué)檢查符合肝癌特征的占位性病變或有兩種肝癌標(biāo)志物（DCP、GGTⅡ、AFU和CA19-9等）陽性及一種影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變者；3.有肝癌的臨床表現(xiàn)并有肯定的肝外轉(zhuǎn)移病灶，排除轉(zhuǎn)移性肝癌者。所有肝癌患者均為乙型肝炎病毒表面抗原陽性，抗HCV陰性，排除患有肝外原發(fā)腫瘤者。同時(shí)選擇健康人20例作為對(duì)照，男14例，女6例；平均年齡45（20～75）歲。

1.2血清AFP和HBV DNA檢測(cè)采用ELISA法,試劑來源于羅氏公司；采用PCR法檢測(cè)HBV DNA（湖南圣湘生物科技有限公司）。

1.3影像學(xué)檢查常規(guī)進(jìn)行CT（256排，西門子公司）或MRI（3.0 T,西門子公司）。

1.4 PBMCs Foxp3檢測(cè)淋巴細(xì)胞分離液購于天津市GBD公司；RT試劑盒、PCR試劑盒、DNA Marker均購于美國Fermetas公司；引物由天津金斯瑞公司合成；PCR儀由德國EPPENDORF公司提供；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)由美國BIORAD公司提供。抽取外周靜脈血3～4 ml，用密度梯度離心法分離PBMCs，提取總RNA，-20℃保存。根據(jù)GeneBank檢索的基因序列，利用Premier 5軟件分別設(shè)計(jì)FOXP3和β-actin引物（內(nèi)部參照系統(tǒng)），見表1。以提取的總RNA 5μL為模板，合成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增Foxp3基因片段。采用同管擴(kuò)增法，反應(yīng)步驟：每管先加入目的基因上下游引物各1μL，加入內(nèi)參β-actin上下游引物各0.1μmol（1μl），反應(yīng)體系為30μl，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)條件為：94℃，2 min（啟動(dòng)）；94℃，30 sec（變性）；57℃，30 sec（退火）；72℃，45 sec（延伸）；再從變性開始循環(huán)共30次。72℃，最后，延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。檢測(cè)水準(zhǔn)為α=0.05，采用雙側(cè)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1 HCC患者和健康對(duì)照人群PBMCs Foxp3 mRNA水平情況HCC患者和健康人PBMCs FoxP3水平分別為（0.976±0.073）和（0.772±0.083），差異顯著（因方差不齊，采用One-Way ANOVA Welch法校正，F(xiàn)＝37.749，P<0.001，圖1、圖2）。

2.2 HCC患者PBMCs Foxp3 mRNA水平與血清AFP水平的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HCC患者FOXP3 mRNA水平與AFP水平呈顯著正相關(guān)（r＝0.226，P＝0.025，圖3）。

3　討論

Trges在腫瘤的免疫耐受及免疫應(yīng)答受抑制方面起著關(guān)鍵的作用[13，14]。Tregs細(xì)胞介導(dǎo)的潛在的抑制作用阻止了有效的免疫應(yīng)答，而這些免疫應(yīng)答對(duì)腫瘤的清除及炎癥的控制是很關(guān)鍵的[15]。而且，Tregs細(xì)胞的消除或功能的抑制能增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答[16～19]。越來越多的證據(jù)表明Tregs細(xì)胞的增加與惡性腫瘤患者病情進(jìn)展相關(guān)[20～23]。目前，研究表明腫瘤患者外周血循環(huán)中Tregs細(xì)胞計(jì)數(shù)增加[24～26]。在胃癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌患者外周血均檢測(cè)出Tregs細(xì)胞數(shù)增加[27]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中亦有相應(yīng)的發(fā)現(xiàn)。有研究顯示在患惡性腫瘤的大鼠，隨著Tregs細(xì)胞的減少，其抗腫瘤免疫隨之增強(qiáng)[16]。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，過繼輸入CD4+CD25+Treg細(xì)胞能防止或治療小鼠自身免疫性疾病，延長移植物的存活，而CD4+CD25+Tregs細(xì)胞的缺失能誘導(dǎo)自身免疫性疾病，增強(qiáng)抗腫瘤免疫[28]。基于小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯拷沂厩宄齌reg細(xì)胞后，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答明顯增強(qiáng)；清除Treg細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞后，CD4+T細(xì)胞也能通過IFN-γ依賴機(jī)制排斥腫瘤細(xì)胞，恢復(fù)Treg細(xì)胞后，抗腫瘤免疫應(yīng)答立即被抑制[29]。這些足以說明Treg細(xì)胞和腫瘤的發(fā)生有直接的關(guān)系。Treg可能通過抑制腫瘤抗原的表達(dá)或淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤的免疫耐受[29]。

近年，國內(nèi)外報(bào)道Treg細(xì)胞對(duì)肝癌患者的疾病進(jìn)展也起到了至關(guān)重要的作用[30]，可能因?yàn)檎{(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制肝癌患者外周血和肝臟CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而可能促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。有相關(guān)研究報(bào)道Treg細(xì)胞可以抑制CD8+T細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子的分泌和穿孔素表達(dá)，從而抑制效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用。Ormandy et al研究發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血Tregs細(xì)胞明顯增加。有學(xué)者對(duì)肝癌患者進(jìn)行臨床多因素研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例增高是肝癌患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Gao et al研究表明HCC組織Tregs細(xì)胞數(shù)量與腫瘤大小及血管侵潤相關(guān)。Yang J et al研究發(fā)現(xiàn)不僅外周血及肝癌組織中Foxp3 Tregs細(xì)胞明顯增加，而且Tregs細(xì)胞的數(shù)量與血清AFP水平呈正相關(guān)。Sasaki et al研究亦發(fā)現(xiàn)Tregs與AFP間存在相關(guān)性。

Tregs細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特細(xì)胞群，而Foxp3是它的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Treg細(xì)胞常用的分子標(biāo)記有CD4+CD25+Tregs、Foxp3、CD127等。Foxp3被稱為叉狀頭（或）翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在T細(xì)胞上特異性表達(dá)，并且是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能所必需的，可反映Treg的水平和功能活性，目前被作為證實(shí)Treg細(xì)胞存在的金標(biāo)準(zhǔn)。通過對(duì)小鼠腫瘤模型的研究證實(shí)，腫瘤部位大量Treg細(xì)胞積聚的一個(gè)重要機(jī)制就是CD4+CD25-Treg向CD25+細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，并且轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞表達(dá)FoxP3，從而具有抑制活性。因此，通過檢測(cè)PBMCs中Foxp3 mRNA水平能較好地反映Tregs細(xì)胞的水平，且方法學(xué)上更簡(jiǎn)單易行。我們?cè)O(shè)計(jì)這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)HCC初發(fā)現(xiàn)未治療患者PBMCs中Foxp3 mRNA水平，同時(shí)檢測(cè)患者血清AFP水平，最后對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)它們之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者FoxP3水平明顯高于健康對(duì)照組，它們之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HCC患者Foxp3 mRNA水平與AFP水平呈顯著正相關(guān)，推測(cè)檢測(cè)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Foxp3 mRNA水平對(duì)腫瘤的發(fā)生具有一定的預(yù)測(cè)作用，但Foxp3 mRNA水平升高需持續(xù)多長時(shí)間，且需達(dá)到什么水平才能對(duì)HCC發(fā)生具預(yù)測(cè)作用，尚需更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿：2015-02-28）

（本文編輯：陳從新）

·原發(fā)性肝癌·

Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatocellular carcinoma

Yang

Zhi，Chen Hongtao，Wu Shipin. Department of Infectious Disease，People's Hospital，Second Clinical Medical College Affiliated to Jinan University，Shenzhen 518020，Guangdong Province，China

【Abstract】Objective To investigate Foxp3 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with hepatocellular carcinoma（HCC）and explore its relationship with serum AFP levels. Methods 60 patients with HCC and 20 healthy persons were enrolled in this study. The Foxp3 mRNA in PBMCs was measured by RT-PCR and serum AFP was detected at the same time. Results There existed statistically significant difference in Foxp3 levels between patients with HCC and controls [（0.976±0.073）vs.（0.772±0.083），P<0.01]；Pearson correlation analysis showed positive correlation between Foxp3 levels in PBMCs and serum AFP levels in HCC patients（r＝0.226，P＝0.025）. Conclusion The Foxp3 levels in PBMCs in patients with HCC increase，which might help predict HCC development.

【Key words】Hepatocellular carcinoma；Foxp3；Peripheral blood mononuclear cells；Alpha fetal protein

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.016

通訊作者：吳詩品，E-mail:wupoem@126.com

*基金項(xiàng)目：廣東省科技廳青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：D2011283）