賈復(fù)敏，李悅，卜碧濤

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎動(dòng)物模型制備

賈復(fù)敏1，李悅2，卜碧濤2

目的：制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（EAM）動(dòng)物模型，觀察白介素-6（IL-6）在EAM模型肌肉組織中的表達(dá)。方法：豚鼠20只，隨機(jī)分為模型組12只和對(duì)照組8只，模型組采用純化兔骨骼肌肌球蛋白+弗氏完全佐劑（CFA）免疫注射，對(duì)照組給予CFA+PBS免疫注射，2組均每周免疫1次，連續(xù)6周，并同時(shí)給予2次百日咳菌液腹腔注射。觀察2組臨床表現(xiàn)、血清肌酶水平及肌肉病理，并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IL-6在肌肉組織中的表達(dá)。結(jié)果：模型組豚鼠血清中肌酸激酶、乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。注射免疫第6周末，2組臨床評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），模型組血清肌酶水平與臨床評(píng)分呈正相關(guān)（=0.853，<0.05）。模型組的肌束膜、肌內(nèi)膜和壞死肌纖維處均有IL-6陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組肌肉標(biāo)本幾乎無(wú)IL-6表達(dá)。結(jié)論：EAM模型制備成功，IL-6在其發(fā)病過(guò)程中可能起重要作用。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎；動(dòng)物模型；多發(fā)性肌炎；白介素-6

特發(fā)性炎性肌病是一種獲得性的由自身免疫介導(dǎo)的慢性系統(tǒng)性結(jié)締組織病，其確切的病因及發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明。近年來(lái)的研究表明，免疫機(jī)制是特發(fā)性炎性肌病發(fā)生的主要機(jī)制，各種細(xì)胞因子在其中起到不可忽視的作用。本實(shí)驗(yàn)采用注射免疫的方法制成實(shí)驗(yàn)性肌炎（experimental autoimmune myositis，EAM）動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子白介素-6 （interleukin-6,IL-6）在EAM動(dòng)物模型肌肉組織中的表達(dá)情況，以了解其在炎性肌病發(fā)病過(guò)程中可能起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～12周齡健康雌性豚鼠（普通級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)）20只（由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供），體質(zhì)量260～310 g，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（12只）和對(duì)照組（8只）。2組均觀察到第6周末后處死。

1.1.2 試劑和儀器 純化的兔骨骼肌肌球蛋白5mg/0.5mL、弗氏完全佐劑（complete freund's adjuvant，CFA，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司），百日咳菌液（購(gòu)于北京天壇生物制品研究所），抗CD4抗體（1∶100）、抗CD8抗體（1∶100）（購(gòu)于北京博奧森公司），抗CD68抗體（1∶200）、抗IL-6（1∶300）（購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司）；兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（購(gòu)于丹麥DAKO公司）。Roche型全自動(dòng)生化分析儀（購(gòu)于瑞士羅氏公司），Eppendorf離心機(jī)（購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法 2組均每周免疫1次，連續(xù)6周。免疫方法為背部?jī)蓚?cè)皮下注射免疫物，注射前均需充分混勻。模型組的免疫物為0.25mL （20μg/mL）/只純化的兔肌球蛋白+等量CFA。對(duì)照組的免疫物為0.25 mL CFA+等量1×PBS。免疫注射頭2周，在注射免疫物的基礎(chǔ)上，2組均同時(shí)給予約2μg百日咳菌液腹腔注射[1]。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法 ①臨床癥狀評(píng)估：每周免疫注射前測(cè)豚鼠體重，并根據(jù)豚鼠活動(dòng)情況，參照Lennon評(píng)分方法[2]對(duì)2組豚鼠進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，肌無(wú)力無(wú)明顯表現(xiàn)；1分，動(dòng)物無(wú)力叫喊或咬嚙；2分，靜息時(shí)體位隆起，頭下垂，行走顫抖；3分，肌無(wú)力較嚴(yán)重，體重明顯減輕，甚至肌肉萎縮，不鳴叫，呼吸費(fèi)力，近于死亡（表現(xiàn)居中者為 0.5、1.5或2.5分）。②病理檢查：2組豚鼠末次免疫1周后，經(jīng)4%水合氯醛腹腔注射麻醉（4mL/kg）后，每只于活體情況下四肢肌肉多部位取材，所有標(biāo)本立即用異戊烷-液氮速凍并用25℃恒溫切片機(jī)連續(xù)切片（厚7μm），進(jìn)行HE染色。觀察指標(biāo)：肌纖維變性、壞死、再生；肌內(nèi)膜、肌束膜、肌外膜及小血管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)；中央核；微血管病變（內(nèi)膜增厚或閉塞）；脂肪及其他結(jié)締組織增生。③血清肌酶水平的測(cè)定：取材后，立即于心臟采血2～3mL，用 Eppendorf離心機(jī)離心 10 min （3 000 r/min）分離血清，用Roche型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）的數(shù)值變化。④SABC免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)冰凍切片，免疫組織化學(xué)法測(cè)定CD4、CD8、CD68及IL-6在豚鼠肌肉組織中的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

注射免疫2周后，所有動(dòng)物局部均產(chǎn)生硬結(jié)。對(duì)照組8只動(dòng)物注射免疫后局部有直徑0.3～0.5 cm硬結(jié)，約3～4周后，其中5只豚鼠硬結(jié)破潰，后又自愈，其余3只豚鼠硬結(jié)無(wú)破潰，逐漸變小、消失。對(duì)照組豚鼠各項(xiàng)活動(dòng)無(wú)明顯異常，體重逐漸增加。模型組12只豚鼠皮下注射2周后，局部均有直徑約0.5～1 cm的硬結(jié)。除少數(shù)豚鼠硬結(jié)未破潰，整個(gè)免疫過(guò)程中臨床癥狀不明顯，有的接近于對(duì)照組外，其余豚鼠第3周后背部皮膚脫毛、硬結(jié)變軟、紅腫，有波動(dòng)感、局部溫度升高。第4周時(shí)最明顯，硬結(jié)破潰，有大量黃白色、較稠、微臭的液體溢出；且其中有5只豚鼠有胸腺、頸部淋巴結(jié)腫大，2只有腹股溝淋巴結(jié)腫大。第5周破潰處開(kāi)始慢慢結(jié)痂、愈合。1只豚鼠于免疫第5周時(shí)死亡，主要表現(xiàn)為進(jìn)食和呼吸費(fèi)力，死后尸體解剖其他臟器未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變，肌肉活檢發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，死亡原因主要考慮由肌炎引起的吞咽和呼吸功能衰竭所致。剩余有癥狀的豚鼠（7只）在第4周左右表現(xiàn)最明顯，主要為對(duì)稱性四肢無(wú)力，以雙下肢最為嚴(yán)重，行走顫抖，體重下降，毛色無(wú)光澤及脫落。

2.2 血清肌酶水平測(cè)定結(jié)果

模型組豚鼠血清中CK、LDH、AST的平均水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05），見(jiàn)表1 。

表1 2組豚鼠肌酶測(cè)定結(jié)果（IU/L，±s）

注：與對(duì)照組比較，①<0.05

組別 只數(shù) CK LDH AST對(duì)照組 8 792.0±142.6 111.8±37.4 103.8±25.1模型組 12 2099.6±884.1① 254.7±78.8① 204.5±75.0①

2.3 臨床評(píng)分

模型組的臨床評(píng)分于第3周開(kāi)始升高，于第6周末為（1.62±1.05）分，對(duì)照組為0分，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。

2.4 血清肌酶水平與臨床評(píng)分之間的相關(guān)性

注射免疫第6周末，模型組血清肌酶水平與臨床評(píng)分呈正相關(guān)（=0.853，< 0.05），見(jiàn)圖1。

2.5 肌肉病理及組化染色

模型組的主要改變包括肌纖維變性、壞死、偶有再生；肌纖維間的小血管周圍有炎性細(xì)胞圍繞，管壁增厚，甚至閉塞；肌外膜、肌束膜、肌內(nèi)膜也有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組肌肉組織未見(jiàn)肌纖維變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肌肉標(biāo)本免疫組化染色顯示肌束膜和間質(zhì)內(nèi)有許多CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見(jiàn)于肌內(nèi)膜；CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)肌內(nèi)膜，其數(shù)目少于CD4+T淋巴細(xì)胞；CD68+巨噬細(xì)胞也主要浸潤(rùn)肌內(nèi)膜，可見(jiàn)吞噬現(xiàn)象，在壞死肌纖維處明顯陽(yáng)性表達(dá)；肌束膜、肌內(nèi)膜和壞死肌纖維處均有IL-6陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組肌肉標(biāo)本幾乎無(wú)IL-6表達(dá)，見(jiàn)圖2。

3 討論

骨骼肌肌球蛋白是自身免疫性疾病研究的動(dòng)物模型常見(jiàn)誘導(dǎo)物[3,4]。本實(shí)驗(yàn)采用純化的兔骨骼肌肌球蛋白作為抗原，并同時(shí)加入CFA及百日咳菌液（前2次）連續(xù)6次免疫豚鼠，成功地誘導(dǎo)出EAM模型，陽(yáng)性率約達(dá)66.7%，對(duì)照組無(wú)1例發(fā)病，這說(shuō)明骨骼肌肌球蛋白是EAM的自身抗原，與國(guó)外研究一致[5]。

EAM與人類多發(fā)性肌炎（polymyositis，PM）在病理上有相似之處，如模型組肌肉HE染色顯示肌纖維變性、壞死，偶見(jiàn)再生，一些炎性細(xì)胞浸潤(rùn)肌纖維內(nèi)膜，免疫組化染色顯示肌內(nèi)膜浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞主要是CD8+T細(xì)胞和CD68+巨噬細(xì)胞。其CD8+T細(xì)胞主要侵襲非壞死肌纖維，CD68+巨噬細(xì)胞大部分在壞死肌纖維附近。此外，也可見(jiàn)小血管周圍有大量炎性細(xì)胞圍繞，血管壁增厚，甚至閉塞，最終可能會(huì)導(dǎo)致血管數(shù)量減少，肌纖維進(jìn)而繼發(fā)缺血壞死。近來(lái)研究表明微循環(huán)受損也參與PM的發(fā)病，尤其在PM發(fā)病的早期階段[6]。但EAM模型的病理特征也有別于人類PM，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞不僅有CD8+T細(xì)胞，在肌內(nèi)膜（少數(shù)）、肌束膜、肌外膜區(qū)域也可見(jiàn)到大量CD4+T淋巴細(xì)胞，且 CD4+T細(xì)胞的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于CD8+T細(xì)胞，這種現(xiàn)象可能與炎癥處于免疫反應(yīng)早期階段有關(guān)[7]。此外在臨床表現(xiàn)、CK水平上也有相似之處，模型組大部分（約58%）豚鼠在免疫注射第4周左右開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少，體重緩慢下降，對(duì)稱性四肢無(wú)力，雙下肢最為嚴(yán)重，行走顫抖，甚至爬行。于免疫注射第6周末，血清CK水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。但對(duì)照組中個(gè)別豚鼠血清CK水平（輕度升高）與模型組接近，這可能由 難以控制的溶血造成的[8]。此實(shí)驗(yàn)中模型組豚鼠臨床評(píng)分與CK水平經(jīng)相關(guān)性分析，兩者呈正相關(guān)。但也發(fā)現(xiàn)約25%的豚鼠的臨床評(píng)分與血清CK水平不平行，該情況在臨床中也較常見(jiàn)，具體原因尚不清楚。另外約16.7%豚鼠肌無(wú)力等臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，血清CK水平升高，但肌肉病理并無(wú)明顯改變，這一現(xiàn)象可能與疾病正處于急性期，肌肉炎性反應(yīng)并未到達(dá)高峰，肌細(xì)胞損傷較輕，致使肌肉病理改變不明顯，血清CK水平升高可能由EAM累及心肌造成的。上述本實(shí)驗(yàn)無(wú)法完全解釋的現(xiàn)象，將成為下一步探討的方向。

IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，它能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)[9]，其在炎癥和免疫反應(yīng)中的信號(hào)調(diào)節(jié)失?？赡軐?dǎo)致一些疾病的開(kāi)始及維持，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。且它已被證實(shí)在許多實(shí)驗(yàn)性自身免疫性疾病中扮演重要角色，如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎等[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察到IL-6在模型組肌肉組織中表達(dá)顯著增多，主要表達(dá)在肌內(nèi)膜和壞死的肌纖維處，尤其是壞死肌纖維，且壞死嚴(yán)重區(qū)域比較輕區(qū)域表達(dá)明顯，這意味著IL-6可能與肌纖維壞死有關(guān)，參與EAM的發(fā)病。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)免疫組化染色顯示CD68+巨噬細(xì)胞的陽(yáng)性分布與IL-6陽(yáng)性結(jié)果分布比較相似，筆者推測(cè)CD68+的巨噬細(xì)胞可能是IL-6細(xì)胞因子的主要來(lái)源，這曾在國(guó)外C-蛋白誘導(dǎo)型肌炎（C protein-induced myositis，CIM）模型中有報(bào)道[11]。但近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)受損肌細(xì)胞本身也可能分泌IL-6[12]，其主要來(lái)源有待進(jìn)一步證實(shí)。IL-6可能參與EAM發(fā)病的具體機(jī)制尚不清楚，在炎性環(huán)境下，IL-6可與其受體結(jié)合刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1，使淋巴細(xì)胞遷移至炎癥區(qū)域；IL-6也可誘導(dǎo)肌纖維產(chǎn)生細(xì)胞間黏附分子-1，細(xì)胞間黏附分子-1 與CD8+T淋巴細(xì)胞膜上淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子-1相結(jié)合增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性[13]。除此之外，它也可能促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[13]，而Th17細(xì)胞目前已被證實(shí)參與一些EAM疾病動(dòng)物模型的形成，并在其中起關(guān)鍵作用[14]；這提示IL-6也可能參與人類PM的發(fā)病，并可能在其中起重要作用。

志謝 感謝中國(guó)人民解放軍北京總醫(yī)院神經(jīng)科蒲傳強(qiáng)教授給予的大力支持！

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（本文編輯：王晶）

Objective:To establish an animal model of experimental autoimmune myositis(EAM),and to observe the expression of IL-6 in the muscle of animals.Methods:Twenty guinea-pigs were randomly assigned into EAM group (n=12)and control group (n=8).The EAM group was subcutaneous injected with rabbit skeletal muscle myosin plus Freund's complete adjuvant(CFA),and the control group was received CFA and equal amount of PBS.Each guinea-pigs received twice injection of pertussis toxin.The animals in both groups were immunized once a week,lasting for 6 weeks.The clinical manifestation,the serum muscular enzymes levels and pathology of the skeletal muscles were observed.The immunohistochemistry technique was used to detect the expression of IL-6 in the muscle tissue.Results:The serumLevels of creatine kinase,lactate dehydrogenase and aspartate aminotransferase of the EAM group were increased significantly,compared with those of the control group (<0.05).At the 6th week,there was statistical difference of the 2 groups in the clinical scores,and the serum muscular enzyme levels were positively correlated with the clinical scores in the EAM model group(=0.853,<0.05).In the perimysium,endomysium,necrotic fibers of the EAM group,the level of IL-6 was dramatically up-regulated compared with control group with rare expression.Conclusion:The establishment of EAM animal model is successful.IL-6 may play an important role in the pathogenesis of EAM.

experimental autoimmune myositis;animal model;polymyositis;interleukin-6

R741;R746.9

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.003

1.湖北省新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430015

2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430030

2014-09-01

卜碧濤bubitao@tjh.tjmu.edu.cn