王 偉，崔廣冉，馬天怡，辛娟娟，劉 波，蔡志平 (.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，內(nèi)蒙古 包頭0400;.包頭醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭04060)

腦卒中是當(dāng)今世界范圍內(nèi)導(dǎo)致患者死亡或致殘的第3 大原因，僅次于心臟病和癌癥。全球有5 000 多萬的缺血性腦卒中和短暫性腦缺血(transient ischemic attack，TIA)生存者。隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，近幾年腦卒中發(fā)病率有上升趨勢(shì)，并趨向年輕化［1］。我國(guó)腦卒中發(fā)生率以每年8.7%的速率上升［2］，在所有的卒中患者中，缺血性卒中大約占85%。因此對(duì)缺血性卒中的發(fā)病原因及卒中后神經(jīng)功能缺損癥狀恢復(fù)的研究，一直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，同時(shí)也是一個(gè)重大的社會(huì)問題。本研究利用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occulsion，MCAO)的方法制備腦缺血再灌注損傷的模型，腹腔注射不同劑量的丹紅注射液觀察其是否具有治療效果，為中藥治療腦卒中提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步發(fā)揮傳統(tǒng)中藥的治療優(yōu)勢(shì)奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性SD 大鼠90 只，體質(zhì)量220 ～250 g，所有動(dòng)物均購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作及飼養(yǎng)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，動(dòng)物隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組。丹紅注射液(批號(hào)Z20026866)為菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn)。維腦路通注射液(批號(hào)19912337656)為天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物模型及各組處理方法

大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞動(dòng)物制備參照longa 法并加以改進(jìn)［3］。10%的水合氯醛按每100 g 體質(zhì)量注射0.35 mL 腹腔麻醉。麻醉成功后，頸部正中切口，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，確認(rèn)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈后，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，于頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處做1 個(gè)小切口，將球狀的單絲尼龍線插入，松開動(dòng)脈瘤夾，直視下尼龍線自動(dòng)脈分支處插入頸內(nèi)動(dòng)脈阻塞大腦中動(dòng)脈入口。缺血3 h 后，拔線栓，梗阻后再灌注24 h。

大鼠完全清醒后隨機(jī)分為4 組(每組20 只)，分別為對(duì)照組、丹紅注射液高、低劑量組和維腦路通組，其中丹紅高、低劑量組根據(jù)大鼠體質(zhì)量分別給予丹紅注射液14.4 mg/kg、3.6 mg/kg腹腔注射，維腦路通組給予0.04 g/kg 的劑量腹腔注射給藥，每天1 次，對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水腹腔注射，共給藥3 d。末次給藥1 h 后，動(dòng)物用10%水合氯醛(30 mg/kg)麻醉，開顱取腦。

1.3 各組動(dòng)物觀測(cè)評(píng)分

1.3.1 橫木行走實(shí)驗(yàn) 利用橫木行走實(shí)驗(yàn)及抓握力測(cè)試［4］評(píng)價(jià)大鼠腦缺血損傷后運(yùn)動(dòng)的整合和協(xié)調(diào)能力。橫木厚1.0 cm，寬2.0 cm，長(zhǎng)120 cm，懸空放置于距地面80 cm 水平，橫木一端連接一個(gè)暗盒，通過刺激大鼠走過橫木進(jìn)入暗盒的方法進(jìn)行測(cè)試。實(shí)驗(yàn)造模前訓(xùn)練4 d，每天1 次，讓所有大鼠評(píng)分到6 分為止，分別于動(dòng)物造模后的各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不能呆在橫木上者為0 分;能在橫木上站住但不能動(dòng)者為1 分;試圖通過但直接從橫木上摔下者為2 分;能夠通過但損傷的后肢滑落下橫木，滑落次數(shù)超過5 次的大鼠評(píng)分為3 分;從橫木上滑落超過1 次但不到5 次者為4 分;從橫木上滑落1 次者為5 分;能夠順利通過橫木者為6 分。

1.3.2 抓握力量測(cè)試 為了檢測(cè)大鼠雙前肢抓握力量的大小，利用抓握力量測(cè)試評(píng)價(jià)大鼠腦缺血后兩前肢抓握橫桿的拉力。測(cè)試者拉住鼠尾向后拖拽，大鼠為了不從橫桿滑脫，會(huì)抓握橫桿不放，讀取使大鼠雙前肢滑脫的最大拉力值。分別于實(shí)驗(yàn)造模3 d、7 d 和14 d 后進(jìn)行測(cè)量，每只測(cè)2 次，取其最大值。

1.3.3 大鼠腦梗死灶測(cè)量 TTC 與細(xì)胞內(nèi)脫氫酶反應(yīng)后腦組織會(huì)變成紅色，而腦缺血梗塞部位的細(xì)胞脫氫酶失活不能與TTC 反應(yīng)呈蒼白色。大鼠腦缺血再灌注24 h 后，麻醉取腦，立即置于－20 ℃低溫冰箱快速冷凍20 min，由前向后冠狀面切片，片厚3 mm，均勻切6 片。同時(shí)在3 d 后各組再取2 只大鼠進(jìn)行腦組織切片測(cè)量梗塞面積。已切好的腦切片放到1% TTC溶液的玻璃器皿中，腦切片全部浸沒，置于37 ℃恒溫烤箱避光加熱，染色15 min 后，組織切片翻面后繼續(xù)避光染色約15 min，切面上正常腦組織染色呈紅色，梗死區(qū)域的腦組織呈蒼白色，染好的腦切片置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。腦梗面積的計(jì)算:由于腦組織的水腫程度隨著腦缺血后再灌時(shí)間的不同而變化，為了消除腦水腫對(duì)腦梗面積檢測(cè)的影響，每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取2 只大鼠，按切片順序進(jìn)行每只大鼠腦組織標(biāo)本的6 個(gè)切片測(cè)量，測(cè)量后據(jù)以下公式來計(jì)算每一層面上腦梗塞面積:100 ×［對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)的面積－(同側(cè)大腦皮質(zhì)的面積－腦梗塞的面積)］/對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)的面積。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠橫木行走實(shí)驗(yàn)得分

對(duì)照組大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其橫木的行走能力也出現(xiàn)一定的恢復(fù)，但與用藥組相比，仍然有明顯的差異。在各用藥組中，可見大鼠橫木行走能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯改善，且藥物組大鼠橫木行走能力的表現(xiàn)明顯優(yōu)于對(duì)照組，二者相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。在藥物組內(nèi)部，可見丹紅高低劑量組的大鼠橫木行走能力要高于維腦路通組(P ＜0.05)，但在丹紅高、低劑量組之間比較差異并不明顯，在觀察周期末大鼠的橫木行走能力幾乎接近于健康大鼠(表1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間段橫木行走得分(±s，分)

表1 各組大鼠不同時(shí)間段橫木行走得分(±s，分)

* :與對(duì)照組比較，P ＜0.05

?

2.2 各組大鼠造模后不同時(shí)間段握力測(cè)量值

各組大鼠不同時(shí)間段測(cè)量抓握力見表2。第3 天時(shí)，各組大鼠的抓握力差別不大，但丹紅高劑量組的抓握力與其他幾組相比，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。第7 天時(shí)，可見用藥組與對(duì)照組抓握力有明顯差異(P ＜0.05)。而在藥物組內(nèi)部?jī)蓛上啾?，未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第14 天時(shí)，與對(duì)照組相比，可見藥物組各組抓握力都比對(duì)照組要大，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有明顯差異(P ＜0.05)，藥物組組內(nèi)相比差異并不明顯，還不能說明丹紅高低劑量組與維腦路通組相比有任何差異。

表2 各組大鼠不同時(shí)間段抓握力測(cè)量值(±s，gf)

表2 各組大鼠不同時(shí)間段抓握力測(cè)量值(±s，gf)

* :與對(duì)照組比較，P ＜0.05

?

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)腦梗塞面積與正常面積比例測(cè)量結(jié)果

各組大鼠在不同時(shí)間段進(jìn)行梗塞面積測(cè)量，結(jié)果見圖1。與各用藥組相比，生理鹽水組(對(duì)照組)分別在24 h 與3 d 時(shí)間點(diǎn)可見梗塞面積都高，與其他各組相比差異明顯(P ＜0.05)。在用藥組間比較時(shí)，24 h 時(shí)間點(diǎn)可見丹紅組(高低劑量)梗塞面積比例要小于維腦路通組，在3 d 時(shí)間點(diǎn)可見丹紅高劑量組梗塞面積比例明顯低于對(duì)照組，二者相比結(jié)果有明顯差異(P ＜0.05)。

圖1 各組大鼠不同時(shí)間段梗塞面積測(cè)量

3 討論

目前研究腦缺血的模型很多，但腦缺血再灌注損傷動(dòng)物模型的研究選擇，一直以來都是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)［5-6］。比較經(jīng)典的方法是Longa 模型［3］，但國(guó)內(nèi)一般都會(huì)對(duì)該類模型進(jìn)行適當(dāng)?shù)母牧?。本研究采用了改良的Longa 模型，此模型的操作由一人完成，在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了大量的定位實(shí)驗(yàn)，在這些基礎(chǔ)上確保造模成功。實(shí)驗(yàn)操作均由一人完成，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)率高，模型的性狀穩(wěn)定，保證了下一步實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

目前應(yīng)用丹紅臨床治療方面，國(guó)內(nèi)高春光等［7］通過對(duì)TIA 患者用丹紅和蘆丁靜脈滴注，丹紅組治愈率為61.3%，好轉(zhuǎn)率38.7%，總有效率100%，蘆丁組總有效率為90.3%。巴瑞瓊等［8］采用丹紅注射治療腦梗死，對(duì)照組用臨床常用的復(fù)方丹參注射液，結(jié)果對(duì)照組總有效率為72%，治療組為89.33%，且丹紅治療對(duì)血液流變學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)有所下降，表明其有改善血液流變學(xué)的作用。另外有研究利用丹紅治療缺血性腦卒中，丹紅治療的總有效率更高，可有效改善急性腦梗死患者的預(yù)后［9-11］。本研究結(jié)果顯示，利用丹紅治療，大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)與維腦路通組相比并無明顯差異，表明二者的作用無明顯差別，與國(guó)內(nèi)的研究結(jié)果相似。辛勤等［10］利用丹紅治療腦栓塞，發(fā)現(xiàn)大鼠在腦指數(shù)，腦含水量、腦血管通透性各方面都能減輕腦缺血引起的損傷。國(guó)外應(yīng)用丹紅注射液對(duì)腦卒中進(jìn)行治療的研究并不多，關(guān)于這方面轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究也不是很多，利用丹紅進(jìn)行研究，結(jié)合近年的趨勢(shì)，希望為臨床及基礎(chǔ)研究奠定一定的基礎(chǔ)。近年對(duì)于腦卒中本身神經(jīng)生物標(biāo)記分子的研究還比較少，因此這也是我們進(jìn)一步利用該模型和丹紅注射液進(jìn)行研究的方向。

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