周明明，李曉雁，陳 悅，陳彥梅，黃海東，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

鞘氨醇單胞菌TP-3原生質(zhì)體制備與再生的研究

周明明1，李曉雁2，陳 悅2，陳彥梅1，黃海東1，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384）

研究了EDTA預(yù)處理、菌齡、溶菌酶濃度、酶解溫度及酶解時間對鞘氨醇單胞菌TP-3原生質(zhì)體制備與再生的影響。結(jié)果表明：10 mmol/L EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，菌齡18 h，酶濃度60 μg/mL，酶解溫度32℃，酶解時間30 min時，菌株原生質(zhì)體的形成率可達(dá)96.1%，再生率達(dá)32.2%。本文為進(jìn)行原生質(zhì)體融合選育優(yōu)良微生物菌種奠定了基礎(chǔ)。

鞘氨醇單胞菌，原生質(zhì)體，影響因素

食品膠是一類天然高分子聚合物的統(tǒng)稱，這類物質(zhì)充分水化后能形成黏稠、滑膩或凝膠狀的高分子水溶膠，在食品加工中可以起到增稠、乳化、膠凝等作用[1-2]。食品膠按來源可分為植物膠、動物膠、微生物膠、海藻膠和化學(xué)改性膠，其中微生物膠性能優(yōu)良、用途廣泛、資源取之不竭，與其他來源的食品膠相比，生產(chǎn)周期短、不受氣候、地理環(huán)境和自然災(zāi)害的影響，其產(chǎn)品研發(fā)和應(yīng)用日益受到重視[3-6]。

鞘氨醇單胞菌是合成微生物膠的重要微生物資源，該菌屬的菌株能合成包括結(jié)冷膠在內(nèi)的一類生物聚合物，統(tǒng)稱為鞘氨醇膠。菌株TP-3是從土壤中分離到的一株鞘氨醇單胞菌屬的新種Sphingomonas sanxanigenens，其發(fā)酵合成的產(chǎn)物命名為鞘氨醇膠Ss，此膠具有優(yōu)越的增稠性和剪切稀釋性，在含鈣離子的水溶液中低濃度即可形成凝膠[7-8]。將菌株TP-3的發(fā)酵液pH調(diào)至3.0左右，鞘氨醇膠Ss即可沉淀出來，與其他鞘氨醇膠所采用的有機(jī)溶劑沉淀法提取相比，酸沉提取能夠顯著地降低生產(chǎn)成本。本文對菌株TP-3的原生質(zhì)體制備與再生條件進(jìn)行了研究，為利用原生質(zhì)體融合選育優(yōu)良菌株，進(jìn)一步提高該菌株的產(chǎn)物合成量和生產(chǎn)性能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種S.sanxanigenens TP-3 由本實(shí)驗室保藏；固體培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖15.0，蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，酵母膏3.0，瓊脂粉15.0，pH7.0；液體培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖15.0，蛋白胨2.5，磷酸氫二鉀2.5，磷酸氫二銨1.5，硫酸鎂0.1，酵母粉1.5，pH7.0；補(bǔ)充基本培養(yǎng)基（BNK）（g/L） 蔗糖181.0，蛋白胨5.0，牛肉膏3.0，瓊脂粉20.0，pH7.0；再生補(bǔ)充培養(yǎng)基（BZNK）（g/L） BNK配方中瓊脂改為8.0；磷酸緩沖液 0.1 mol/L磷酸氫二鈉，0.1 mol/L磷酸二氫鈉，pH7.0；高滲緩沖液0.1 mol/L磷酸氫二鈉，0.1 mol/L磷酸二氫鈉，0.8 mol/L甘露醇，pH7.0；原生質(zhì)體穩(wěn)定液（SMM） 0.5 mol/L蔗糖，20 mol/L MgCl2，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH6.5；溶菌酶 用SMM溶液配制，終濃度0.5 mg/mL，過濾除菌備用；磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨、硫酸鎂、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甘露醇、MgCl2、順丁烯二酸等 均為分析純；酚藏花紅染色劑 購自Sigma公司。

KYC-100C搖床 上海?，敼?；TGL16A臺式高速離心機(jī) 潮南凱達(dá)公司；WH-2微型旋渦混合儀 上海滬西公司；BA410熒光顯微鏡 廈門Motic公司；NDJ-1旋轉(zhuǎn)粘度計 上海精密公司；STARTER 2100實(shí)驗室pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DHG-9078A型電熱恒溫鼓風(fēng)烘干箱 上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；MCO-15A型恒溫培養(yǎng)箱 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；BCM-1000A生物潔凈工作臺 蘇州安泰潔凈有限公司；FA2004電子天平 上海精密天平；電子顯微鏡 日本Philips EM400-ST。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 菌種活化 取保藏的TP-3菌種劃線接種到平板上，30℃恒溫培養(yǎng)72 h，挑取單菌落在試管斜面上蛇形劃線，30℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2.2 菌株發(fā)酵曲線測定 取5 mL無菌水將斜面試管中的菌體沖洗下來，按10%的接種量將其接種到液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h。每隔6 h取一次樣，并測定發(fā)酵液的pH、粘度、菌數(shù)和鞘氨醇膠Ss產(chǎn)量。

1.2.3 發(fā)酵參數(shù)的測定 使用校準(zhǔn)后的pH計測定發(fā)酵液的酸堿度；在6 r/min的條件下，使用3號轉(zhuǎn)子測定發(fā)酵液的粘度；發(fā)酵液無菌取樣后，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取0.1 mL稀釋樣涂布于固體平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3 d后進(jìn)行菌落計數(shù)，計算發(fā)酵的菌數(shù)指標(biāo)；發(fā)酵過程中取樣，加入1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至3.0，沉淀的產(chǎn)物過濾后80℃恒溫干燥至恒重，稱重得發(fā)酵產(chǎn)物量。

1.2.4 原生質(zhì)體的制備 菌株TP-3液體培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，取適量菌液在8000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，用磷酸緩沖液洗滌菌體細(xì)胞。將菌體懸浮于適量的SMM緩沖液中，使溶液中細(xì)胞濃度約為108～109CFU/mL。取0.1 mL菌懸液，用無菌水稀釋到10-5、10-6、10-7，涂布平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)4 d后得菌落數(shù)A（菌落總數(shù)）。取剩余的菌懸液，在其中加入溶菌酶，混合均勻后于37℃保溫30 min，4000 r/min離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，取菌液0.1 mL，用無菌水稀釋到10-2、10-3、10-4，涂布平板培養(yǎng)基，進(jìn)行剩余菌數(shù)B（未被酶裂解的剩余細(xì)胞）的測定。

1.2.5 原生質(zhì)體的再生 取0.1 mL酶解后的原生質(zhì)體懸液，用SMM緩沖液稀釋到10-3、10-4、10-5，各取1 mL加入底層BNK培養(yǎng)基的中央，再倒入上層BZNK培養(yǎng)基，混勻，30℃培養(yǎng)4～5 d后計數(shù)，將菌落數(shù)計為C（再生菌落數(shù)）。原生質(zhì)體形成率與再生率的計算公式如下：原生質(zhì)體形成率（%）=（A-B）/A×100，原生質(zhì)體再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。

1.2.6 原生質(zhì)體制備與再生的影響因素

1.2.6.1 EDTA預(yù)處理對原生質(zhì)體制備與再生的影響 酶解前，在菌齡18 h，酶濃度100 μg/mL，酶解溫度37℃，酶解時間30 min的固定條件下，加入2～14 mmol/L濃度梯度的EDTA對菌懸液進(jìn)行預(yù)處理，測定原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

1.2.6.2 青霉素濃度對原生質(zhì)體制備與再生的影響用10 mmol/L EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，菌齡為18 h，酶濃度100 μg/mL，溫度37℃，酶解時間30 min的固定條件下，加入0～100 μg/mL的青霉素預(yù)處理2 h，測定原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

1.2.6.3 菌齡對原生質(zhì)體制備與再生的影響 依據(jù)1.2.2發(fā)酵曲線中的結(jié)果，用10 mmol/L EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，酶濃度100 μg/mL，溫度37℃，酶解時間30 min的固定條件下，選擇6～36 h的細(xì)菌培養(yǎng)物制備原生質(zhì)體，測定原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

1.2.6.4 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體制備與再生的影響用10 mmol/L EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，菌齡18 h，溫度37℃，酶解時間30 min的固定條件下，取10～120 μg/mL的溶菌酶制備原生質(zhì)體，測定原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

1.2.6.5 酶解溫度對原生質(zhì)體制備與再生的影響 用10 mmol/L EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，菌齡18 h，酶濃度100 μg/mL，酶解時間30 min的固定條件下，選擇17～47℃范圍的酶解溫度制備原生質(zhì)體，測定原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

1.2.6.6 酶解時間對原生質(zhì)體制備與再生的影響 用10 mmol/L EDTA對菌體進(jìn)行預(yù)處理，菌齡18 h，酶濃度100 μg/mL，酶解溫度37℃的固定條件下，酶解時間為10～70 min制備原生質(zhì)體，測定原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

1.2.7 原生質(zhì)體制備條件的驗證 在上述原生質(zhì)體各制備因素的基礎(chǔ)上，得到原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件，進(jìn)行各影響因素的綜合實(shí)驗，得出菌株原生質(zhì)體的最高形成率和再生率。

1.2.8 菌體細(xì)胞與原生質(zhì)體的觀察 用接種環(huán)取菌懸液于干凈的載玻片上，晾干，加結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，用水沖洗并晾干，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。細(xì)菌電子顯微鏡觀察方法見參考文獻(xiàn)[9]，配制0.01%的酚藏花紅染色劑[10]，在原生質(zhì)體溶液中按1∶1的比例加入染色劑，將混合溶液滴于載玻片上，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗進(jìn)行三次重復(fù)，應(yīng)用軟件Origin 6.1和Excel 2003對得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株TP-3的發(fā)酵曲線

在實(shí)驗菌株發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，進(jìn)行pH、發(fā)酵液粘度、菌數(shù)和鞘氨醇膠Ss產(chǎn)物量的測定，結(jié)果如圖1所示。從細(xì)胞生長曲線可以看出，菌株TP-3在培養(yǎng)8 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，46 h進(jìn)入穩(wěn)定期，此時菌數(shù)達(dá)1.5×1010CFU/mL；產(chǎn)物鞘氨醇膠Ss的合成曲線與細(xì)胞生長曲線近乎平行，在60 h達(dá)到最高24.1 g/L，結(jié)晶紫染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)的全部階段均能觀察到纖毛狀的產(chǎn)物包裹在細(xì)胞周圍，說明鞘氨醇膠Ss是一種初級代謝產(chǎn)物；發(fā)酵培養(yǎng)在32 h之前，發(fā)酵液的pH基本穩(wěn)定，隨著產(chǎn)物合成量的增加，發(fā)酵液粘度逐漸增加，產(chǎn)物鞘氨醇膠Ss屬于酸性多糖，因此32 h之后發(fā)酵液的pH略有降低。由于整個發(fā)酵周期中，胞外均存在高分子多糖，不利于原生質(zhì)體的制備，提示應(yīng)該選擇發(fā)酵液粘度低、產(chǎn)物合成少的發(fā)酵階段，進(jìn)行原生質(zhì)體制備的研究。

圖1 菌株TP-3的發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation growth curve of strain TP-3

2.2 原生質(zhì)體的制備與再生

2.2.1 EDTA預(yù)處理對原生質(zhì)體制備與再生的影響鞘氨醇單胞菌TP-3為革蘭氏陰性細(xì)菌，結(jié)構(gòu)和成分較革蘭氏陽性菌復(fù)雜，特別是細(xì)胞外壁中的脂多糖及多糖類，會影響溶菌酶的作用。Minghua D等發(fā)現(xiàn)，制備原生質(zhì)體時，在添加溶菌酶之前用EDTA預(yù)處理，可以提高原生質(zhì)體的形成率[11]。本實(shí)驗用EDTA對菌懸液進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果如圖2所示。

圖2 EDTA預(yù)處理對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響Fig.2 Effect of EDTA pretreatment on protoplast formation and regeneration of strain TP-3

隨著EDTA濃度的增大，原生質(zhì)體的形成率在10 mmol/L之前逐漸提高；原生質(zhì)體的再生率則相反，呈下降趨勢。以原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積最大，作為判斷原生質(zhì)體制備最佳條件的依據(jù)[12]，以此標(biāo)準(zhǔn)，選擇10 mmol/L的濃度作為EDTA預(yù)處理的最佳濃度。

2.2.2 青霉素濃度對原生質(zhì)體制備與再生的影響在菌株TP-3液體培養(yǎng)的過程中加入一定量的青霉素，可以在一定程度上提高原生質(zhì)體的形成率（圖3）。與抑制革蘭氏陽性菌的機(jī)理不同，青霉素可以與革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白PBPS發(fā)生結(jié)合，從而干擾細(xì)胞壁代謝，并造成細(xì)胞形變[13]。

圖3 青霉素濃度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響Fig.3 Effect of concentration of penicillin on protoplast formation and regeneration of strain TP-3

從實(shí)驗結(jié)果可以看出，青霉素的加入明顯降低了原生質(zhì)體再生率；在濃度低于20 μg/mL時，使用青霉素有利于原生質(zhì)體的形成，但濃度繼續(xù)升高后，由于細(xì)胞存活率下降，實(shí)驗過程中的剩余細(xì)胞數(shù)量迅速下降，原生質(zhì)體形成率也相應(yīng)降低。

2.2.3 菌齡對原生質(zhì)體制備與再生的影響 菌齡對原生質(zhì)體的制備與再生很重要，處于對數(shù)生長期的細(xì)胞生理狀態(tài)相對一致，細(xì)胞分裂迅速，對酶的敏感性強(qiáng)，易于原生質(zhì)體化和再生[14]。菌齡對原生質(zhì)體制備與再生的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌齡對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響Fig.4 Effect of cell age on protoplast formation and regeneration of strain TP-3

原生質(zhì)體的形成率和再生率都隨著菌齡的增加而下降。說明隨著發(fā)酵時間的延長，菌體細(xì)胞周圍的多糖產(chǎn)物逐漸增多，影響溶菌酶的作用效果；但菌齡過短時細(xì)胞數(shù)量偏低，不利于后續(xù)的原生質(zhì)體融合研究，因此選擇菌齡為18 h作為原生質(zhì)體制備與再生的最佳發(fā)酵時間。

2.2.4 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體制備與再生的影響經(jīng)EDTA預(yù)處理后，實(shí)驗菌株細(xì)胞壁表面的脂多糖層的Ca2+、Mg2被螯合去除，破壞了脂多糖的結(jié)構(gòu)，使溶菌酶可以作用于細(xì)胞壁的肽聚糖[15]。用不同濃度的溶解酶進(jìn)行原生質(zhì)體的制備與再生實(shí)驗，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶濃度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響Fig.5 Effect of concentration of lysozyme on protoplast formation and regeneration of strainTP-3

隨著溶菌酶量的增加，原生質(zhì)體形成率呈上升趨勢，由于細(xì)胞壁破壞影響菌體活性，再生率呈下降趨勢。溶菌酶濃度在10～60 μg/mL范圍內(nèi)，原生質(zhì)體形成率迅速增長，繼續(xù)提高溶菌酶濃度，原生質(zhì)體形成率增加不明顯，但原生質(zhì)體再生率迅速下降。原因可能是隨著酶濃度的增加，酶不僅酶解了細(xì)胞壁，還對早期形成的原生質(zhì)體細(xì)胞膜造成了損傷，再生率下降[12]。依據(jù)原生質(zhì)體形成率與再生率乘積最大原則[12]，選擇溶菌酶濃度為60 μg/mL作為原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。

2.2.5 酶解溫度對原生質(zhì)體制備與再生的影響 原生質(zhì)體制備時，低于酶解最適溫度時，酶活性低，酶解時間長；溫度高于酶解最適溫度時，酶蛋白逐漸變性而使酶失活，不利于原生質(zhì)體的形成[16]。本文對不同的酶解溫度進(jìn)行了實(shí)驗，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解溫度對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響Fig.6 Effect of temperatures of lysozyme on protoplast formation and regeneration of strainTP-3

隨著溫度的升高，原生質(zhì)體的形成率呈上升趨勢，再生率則持續(xù)下降，酶解溫度達(dá)到47℃時，再生率降為0。隨著溫度的升高溶菌酶活性增強(qiáng)，因此原生質(zhì)體形成率增高，再生率的下降一方面是由于溶菌酶對細(xì)胞的損傷，另一方面，菌株TP-3的最適發(fā)酵溫度為28～30℃，溫度過高對菌體本身的內(nèi)酶系統(tǒng)造成破壞，使原生質(zhì)體無法再生[17]。選擇32℃為最佳酶解溫度。

2.2.6 酶解時間對原生質(zhì)體制備與再生的影響 溶菌酶作用時間也是影響原生質(zhì)體制備的重要因素，酶解時間不足，細(xì)胞不能完全去壁；酶解時間過長，會使早期釋放的原生質(zhì)體膜受到傷害，使原生質(zhì)體破碎或再生能力減弱[18]。本文對不同的酶解時間進(jìn)行了實(shí)驗，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解時間對原生質(zhì)體形成率與再生率的影響Fig.7 Effect of operational times of lysozyme on protoplast formation and regeneration of strainTP-3

在酶作用10～30 min之間，原生質(zhì)體的形成率隨酶解時間延長而迅速提高，之后增速緩慢，再生率則呈下降趨勢。酶解30 min后，原生質(zhì)體再生率的迅速下降，說明過長的酶解時間影響了原生質(zhì)體的活性，因此選擇30 min作為原生質(zhì)體形成與再生的最佳酶解時間。

圖8 TP-3菌體細(xì)胞（7000×）Fig.8 Cell of strainTP-3（7000×）

圖9 菌株TP-3的原生質(zhì)體（1000×）Fig.9 Protoplast of strainTP-3（1000×）

2.3 原生質(zhì)體制備條件的驗證

根據(jù)上述實(shí)驗結(jié)果，得到原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件為：10 mmol/L EDTA預(yù)處理，菌齡18 h，溶菌酶濃度60 μg/mL，酶解溫度32℃，酶解時間30 min。在該條件下進(jìn)行驗證實(shí)驗，結(jié)果表明原生質(zhì)體形成率和再生率分別達(dá)到96.1%和32.2%。對原生質(zhì)體制備前后的菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，圖8為菌體細(xì)胞的電子顯微鏡觀察結(jié)果，可以看出菌株TP-3的細(xì)胞為桿狀，大小為0.6～0.9 μm×1.5～2.0 μm，細(xì)胞周圍可以觀察到明顯的纖毛狀產(chǎn)物，鞘氨醇膠Ss。菌株TP-3的原生質(zhì)體進(jìn)行酚藏花紅染色，在熒光顯微鏡下觀察（圖9），大多數(shù)菌體呈類球狀，直徑0.9～1.2 μm，原生質(zhì)體周圍仍然能觀察到多糖產(chǎn)物。

3 結(jié)論與討論

本文對菌株TP-3的原生質(zhì)體制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)EDTA預(yù)處理、菌齡、溶菌酶濃度、酶解溫度和時間等因素對原生質(zhì)體的形成率與再生率影響明顯。由于菌株TP-3外包裹著產(chǎn)物Ss膠，影響了溶菌酶對菌株的作用，進(jìn)而影響原生質(zhì)體的制備。通過優(yōu)化實(shí)驗得出原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件：10 mmol/L EDTA預(yù)處理，菌齡18 h，酶濃度60 μg/mL，酶解溫度32℃，酶解時間30 min，在此條件下菌株原生質(zhì)體的形成率可達(dá)96.1%，再生率達(dá)32.2%。菌株TP-3是鞘氨醇單胞菌屬的新種，該菌株的原生質(zhì)體制備與再生條件的研究還未見報道。實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)加入20 μg/mL濃度以下的青霉素，可干擾細(xì)胞壁合成，原生質(zhì)體形成率有所提高，但使用青霉素后細(xì)菌存活率降低，不利于后期原生質(zhì)體融合育種，因此選擇不加青霉素進(jìn)行預(yù)處理。菌株TP-3原生質(zhì)體周圍仍可以觀察到多糖產(chǎn)物的分泌，進(jìn)一步說明鞘氨醇膠Ss合成后連接在細(xì)胞膜的脂載體上，并不分泌到細(xì)胞壁外。

Ss是鞘氨醇膠家族的一個新品種，增加產(chǎn)物量、提高產(chǎn)品粘度、降低膠凝臨界濃度等諸多研究工作有待開展。對菌株進(jìn)行傳統(tǒng)誘變，獲得目的性狀提高的突變株后，通過多輪遞推式原生質(zhì)體融合，可以快速得到發(fā)酵性狀更優(yōu)良的菌株。原生質(zhì)體的制備和再生是決定融合效率的關(guān)鍵因素，本文為菌株TP-3進(jìn)行原生質(zhì)體融合及基因組改組等育種工作奠定了基礎(chǔ)。

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Conditions for protoplast preparation and regeneration by Sphingomonas sanxanigenens TP-3

ZHOU Ming-ming1，LI Xiao-yan2，CHEN Yue2，CHEN Yan-mei1，HUANG Hai-dong1，*
（1.College of Agronomy and Resources&Environment，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China）

The effect of EDTA pretreatment，cell age and the concentration，temperature and work time of lysozyme on protoplast formation and regeneration by Sphingomonas sanxanigenens TP-3 were studied.The results showed that when cell age was 18 h，pretreated by 10 mmol/L EDTA，using 60 μg/mL of lysozyme，enzymolysis at 32℃for 30 min，the protoplast formation rate and regeneration rate respectively reached 96.1%and 32.2%. This work lay the foundation for protoplast fusion to breed good microbial strain.

Sphingomonas；protoplast；influence factors

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0184-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.030

2015－03－19

周明明（1990-），女，碩士研究生，主要從事微生物多糖方面的研究，E-mail：zmmydx@126.com。

*通訊作者：黃海東（1972-），男，博士，教授，主要從事資源細(xì)菌及工程方面的研究，E-mail：hhaidong@126.com。

國家自然科學(xué)基金項目（31571790）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201410061062）。