Egr-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)糖尿病小鼠腎臟炎癥反應(yīng)的影響*

劉　潔，　張海松，馬永軍，劉　莉，侯明輝，王紅杰，楊　惠(河北大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，腎內(nèi)科，科研處，河北保定07000;滿城縣醫(yī)院腫瘤內(nèi)分泌科，河北滿城070;保定市第一醫(yī)院兒科，河北保定07000)

Egr-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)糖尿病小鼠腎臟炎癥反應(yīng)的影響*

劉潔1，張海松2△，馬永軍4，劉莉5，侯明輝1，王紅杰3，楊惠4
(河北大學(xué)附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2腎內(nèi)科，3科研處，河北保定071000;4滿城縣醫(yī)院腫瘤內(nèi)分泌科，河北滿城072150;5保定市第一醫(yī)院兒科，河北保定071000)

［摘要］目的:觀察Egr-1基因轉(zhuǎn)染對(duì)糖尿病小鼠腎組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)及細(xì)胞間黏附分子1 (ICAM-1)表達(dá)的影響，探討Egr-1在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用。方法:制備糖尿病小鼠模型，成模后隨機(jī)選取10只作為糖尿病組，剩余40只每周1次經(jīng)尾靜脈分別注射空質(zhì)粒、Egr-1表達(dá)質(zhì)粒和Egr-1 siRNA質(zhì)粒，并設(shè)立正常對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)共4周，于第4周末收集各組小鼠腎組織標(biāo)本，分別應(yīng)用western blot和免疫組織化學(xué)染色測(cè)定腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá);應(yīng)用電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:糖尿病小鼠腎組織Egr-1、TNF-α及ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，基底膜普遍增厚，系膜區(qū)基質(zhì)增多，上皮細(xì)胞足突融合; Egr-1基因轉(zhuǎn)染后上述變化趨勢(shì)更加顯著。siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組上述變化較糖尿病組明顯減輕。結(jié)論: Egr-1可上調(diào)TNF-α及ICAM-1表達(dá)，促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖及系膜外基質(zhì)積聚，可能是加速腎小球硬化的可能機(jī)制之一。

［關(guān)鍵詞］早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1;基因轉(zhuǎn)染;糖尿病腎病;腫瘤壞死因子α;細(xì)胞間黏附分子1

早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1(early growth response protein 1，Egr-1)為即刻早期蛋白家族中最重要的一員，在神經(jīng)、循環(huán)、泌尿、呼吸等多個(gè)系統(tǒng)控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡［1］。越來(lái)越多的研究認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等炎癥因子在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起重要的作用，Egr-1可通過(guò)與這些基因啟動(dòng)子上的Egr-1結(jié)合位點(diǎn)作用直接參與其表達(dá)調(diào)控［2］。由此推測(cè)，Egr-1激活可能在糖尿病腎病發(fā)生過(guò)程中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)以糖尿病CD-1小鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將目的基因Egr-1轉(zhuǎn)染至動(dòng)物腎臟組織，使其在靶器官內(nèi)高效表達(dá)，觀察Egr-1對(duì)小鼠腎組織中TNF-α和ICAM-1表達(dá)的影響，探討Egr-1在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

材料和方法

1材料

健康雄性清潔級(jí)CD-1小鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，二級(jí)動(dòng)物合格證號(hào)為0143406，該品系自1999年由美國(guó)Charles River Lab引入，pcDNA3.1-Egr-1、pcDNA3.1由Invitrogen提供。TransIT-EE轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Mirus Bio)鏈脲佐菌素(Sigma) ;兔抗小鼠Egr-1單克隆抗體(Santa Cruz) ;兔抗小鼠TNF-α和ICAM-1多克隆抗體(北京博奧森生物公司)。

2方法

2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選擇CD-1小鼠共50只，經(jīng)單側(cè)腎切除后，隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，其余40只一次性腹膜腔注射STZ(150 mg/kg)，制備糖尿病模型，成模后隨機(jī)選取10只作為糖尿病組，剩余30只經(jīng)尾靜脈分別注射空質(zhì)粒、Egr-1質(zhì)粒和Egr-1 siRNA質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，不使用胰島素及其它降糖藥物。每周1次小鼠尾靜脈注射，正常對(duì)照(normal control，NC)組和糖尿病模型(diabetic)組: 2 mL單純轉(zhuǎn)染系統(tǒng)溶液(TransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solution) ;空質(zhì)粒(pcDNA 3.1)組: 30 μg空質(zhì)粒+2 mL轉(zhuǎn)染系統(tǒng)溶液; Egr-1表達(dá)質(zhì)粒(pc DNA3.1-Egr-1)組: 30 μg Egr-1質(zhì)粒+ 2 mL轉(zhuǎn)染系統(tǒng)溶液; Egr-1 siRNA組: 30 μg Egr-1 siRNA質(zhì)粒+2 mL轉(zhuǎn)染系統(tǒng)溶液，共4周。在注射前30 min將質(zhì)粒和載體混勻，將小鼠放于合適體積的離心管中固定好，用乙醇消毒尾部，使尾靜脈充分充盈，經(jīng)由尾靜脈快速注射。于尾靜脈注射4周末每組取10只小鼠，用代謝籠收集24 h尿，用于測(cè)定尿蛋白(urine protein，UP)，記錄體重(body weight，BW) ; 1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg體重)腹膜腔注射麻醉成功后股動(dòng)脈取血，分離血清，用于測(cè)定血糖(blood glucose，BG)和血肌酐(serum creatinine，SCr) ;切取右腎，濾紙吸干血跡后稱(chēng)重，置于冰臺(tái)上，除掉被膜，取部分腎皮質(zhì)切成1 mm×1 mm×1 mm大小體積，置于4%戊二醛，用于透射電鏡觀察，取部分腎組織置于4%多聚甲醛(0.01 mol/L PBS配制)，體積比大于1/10，固定48 h，用于免疫組化檢測(cè)，其余腎皮質(zhì)組織迅速置于液氮中按Western blot要求制備蛋白裂解液，－80℃保存。

2.2血、尿生化指標(biāo)測(cè)定每個(gè)樣本取20 μL血清和20 μL尿液用AU 2700型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定BG、SCr和UP。

2.3透射電鏡觀察腎皮質(zhì)電鏡標(biāo)本采用戊二醛、鋨酸雙重固定，乙醇、丙酮梯度脫水，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB-V超薄切片，鈾-鉛雙重染色，JOEL-1200EX透射電鏡觀察濾過(guò)膜及系膜病變情況并攝片。

2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水室溫避光孵育10 min;蒸餾水沖洗2次，各5 min;抗原修洗2次，各5 min;取出抗原修復(fù)盒，室溫自然冷卻，約45 min; 0.01 mol/L PBS沖洗2次，每次5 min，滴加I抗，4℃過(guò)夜; 0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min，滴加II抗復(fù)合體，37℃孵育30 min; 0.01mol/L PBS沖洗3次，每次5 min; DAB顯色;蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，光鏡觀察，陽(yáng)性部位呈棕黃色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。每張切片腎皮質(zhì)范圍內(nèi)隨機(jī)選取10個(gè)腎小球(×400)，計(jì)算單位面積陽(yáng)性染色區(qū)域平均積分吸光度(IA)，以各組的均值進(jìn)行比較。

2.5Western blot法檢測(cè)各組小鼠腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)每個(gè)樣品取50 μg總蛋白，加6×SDS加樣緩沖液，在沸水中變性4 min，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜; 5%脫脂奶粉37℃封閉PVDF膜1.5h，I抗(Egr-1和TNF-α I抗工作液濃度為1∶200，ICAM-1 I抗工作液濃度為1∶300，GAPDH I抗工作液濃度為1∶500)，4℃過(guò)夜。TTBS洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或小鼠II抗(1∶18 000稀釋)，37℃孵育2 h; TTBS洗膜，滴加ECL試劑，將PVDF膜放入X光片暗盒，在暗室中壓片，顯影，定影。用UVP的Lab-Works 4.5軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析，讀取積分吸光度值(IA)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，方差齊性檢驗(yàn)用Levene法，計(jì)量資料多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1轉(zhuǎn)染Egr-1基因后小鼠腎重/體重、BG和腎功能的改變

第4周末，糖尿病組較NC組小鼠腎重/體重增加，BG和SCr水平明顯升高，24 h尿蛋白定量明顯增加(P＜0.05)，空質(zhì)粒組和糖尿病組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但pcDNA3.1-Egr-1組變化趨勢(shì)更明顯，與糖尿病組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Egr-1 siRNA組小鼠腎重/體重、BG、SCr及24 h UP較糖尿病組有所下降，但仍高于NC組，見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠BG、腎重/體重、肌酐及尿蛋白的改變Table 1.Results of BG，KW/BW，SCr and UP in different groups (Mean±SD.n=10)

2轉(zhuǎn)染Egr-1基因?qū)π∈竽I組織超微結(jié)構(gòu)改變的影響

透射電鏡結(jié)果顯示:正常對(duì)照組可見(jiàn)基膜厚度正常，足細(xì)胞體積較大，核著色較淺，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。胞體分出大的初級(jí)突起和指狀的次級(jí)突起形成足突，緊貼于毛細(xì)血管基膜外，突起之間可見(jiàn)裂孔。系膜區(qū)無(wú)擴(kuò)張。糖尿病組和空質(zhì)粒組可見(jiàn)足細(xì)胞胞突多呈連續(xù)性附著于基膜上，形成足突融合，腎小球基膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，正常屏障結(jié)構(gòu)喪失。Egr-1表達(dá)質(zhì)粒組上述腎組織的超微結(jié)構(gòu)改變更加顯著; Egr-1 siRNA組上述腎組織的超微結(jié)構(gòu)則明顯改善，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Glomerular ultrastructure under transmission electron microscope in the five groups (×20 000).圖1轉(zhuǎn)染Egr-1基因后各組小鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的改變

3免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)

免疫組化染色顯示，Egr-1主要表達(dá)于腎小球系膜區(qū)、內(nèi)皮細(xì)胞及臟層上皮細(xì)胞、近端和遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞，以胞核著色為主，胞漿偶有著色。TNF-α 和ICAM-1主要表達(dá)于系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞，均以胞漿著色為主。與NC組相比，糖尿病組和空質(zhì)粒組Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)均明顯升高(P＜0.01) ; Egr-1表達(dá)質(zhì)粒組4個(gè)指標(biāo)表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05) ; Egr-1 siRNA組4個(gè)指標(biāo)表達(dá)均明顯下降，但仍高于NC組(P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

4 Western blot檢測(cè)各組小鼠Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組和空質(zhì)粒組Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)均明顯升高(P＜0.01) ;兩組之間上述指標(biāo)的變化無(wú)明顯差異; Egr-1表達(dá)質(zhì)粒組3個(gè)指標(biāo)表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P＜0.05) ; Egr-1 siRNA組3個(gè)指標(biāo)表達(dá)均明顯下降，但仍高于NC組(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

討論

越來(lái)越多的研究證明炎癥在DN的病理過(guò)程中起重要作用［3-4］。糖尿病狀態(tài)下腎小球往往處于炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)，伴有炎癥因子、急性期反應(yīng)產(chǎn)物及其它應(yīng)激分子水平升高，從而激活應(yīng)激激活信號(hào)通路如MAPK/ERK等信號(hào)通路，進(jìn)一步活化Egr-1、NF-κB等核轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)眾多的與炎癥反應(yīng)相關(guān)的下游靶基因表達(dá)，形成瀑布效應(yīng)，加速腎小球硬化。

Egr-1是即刻早期蛋白家族中重要的一員［5-6］，是細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要的上游介質(zhì)［7］。Egr-1在動(dòng)物及人體內(nèi)廣泛分布，多種信號(hào)刺激可誘導(dǎo)其迅速表達(dá)，通過(guò)調(diào)控其下游的一些決定細(xì)胞核型變化的長(zhǎng)期反應(yīng)基因的表達(dá)，參與體內(nèi)眾多的病理生理過(guò)程。Egr-1參與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞凋亡，炎癥和腫瘤［8-9］，還在神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)、促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)，維持女性正常的生殖能力等方面發(fā)揮著一定作用［10-11］。應(yīng)激、缺血缺氧、細(xì)菌內(nèi)毒素、細(xì)胞因子、離子射線、腫瘤等均可引起細(xì)胞膜去極化，激活處于休眠狀態(tài)的Egr-1，使細(xì)胞由G0期進(jìn)入G1期，導(dǎo)致細(xì)胞增殖［12］。研究還發(fā)現(xiàn)，Egr-1還能直接調(diào)節(jié)與細(xì)胞外基質(zhì)代謝有關(guān)的基因表達(dá)，如MT1-MMP、PAI、FN等［2］，表明Egr-1與細(xì)胞外基質(zhì)代謝密切相關(guān)。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中構(gòu)建半腎切除糖尿病CD-1小鼠模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)Egr-1在小鼠腎臟中的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示糖尿病組小鼠腎小球中Egr-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，電鏡下觀察腎小球出現(xiàn)了明顯病理改變，具體表現(xiàn)為基底膜不規(guī)則增厚，部分呈駝峰樣隆起，臟層上皮細(xì)胞足突融合，血管內(nèi)皮細(xì)胞窗孔消失，糖尿病小鼠血肌酐和24小時(shí)尿蛋白均明顯升高，且隨病程逐漸加重，轉(zhuǎn)染Egr-1基因后上述變化進(jìn)一步增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染Egr-1干擾質(zhì)粒后上述變化減弱，進(jìn)一步證明Egr-1表達(dá)增強(qiáng)與腎小球系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)聚集及腎功能下降有關(guān)。

Figure 2.Immunohistochemical staining for Egr-1，TNF-α and ICAM-1 in the renal tissue of all groups(×400).Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05 vs diabetic.圖2各組小鼠腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)

晚近研究表明Egr-1可誘導(dǎo)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。Egr-1不僅可促進(jìn)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入增殖期，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，而且還可通過(guò)細(xì)胞因子如ICAM-1、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、IL-1β、TNF-α等誘導(dǎo)多種炎癥蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)炎癥的發(fā)生［13-14］。炎癥因子包括巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2 (macrophage inflammatory protein 2，MIP 2)、MCP-1、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、干擾素誘生蛋白(interferon-inducible protein，IP) -10以及受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)［15］。Egr-1還可能誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子受體，如趨化因子受體(chemokine receptor，CCR)和CXCR的表達(dá)而加重炎癥過(guò)程。有些研究通過(guò)調(diào)節(jié)Egr-1的表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，已有確切證據(jù)證實(shí)TNF-α基因啟動(dòng)子內(nèi)含有Egr-1結(jié)合位點(diǎn)，Egr-1通過(guò)與此位點(diǎn)與TNF-α結(jié)合而調(diào)控其的表達(dá)。Silverman等［16］通過(guò)基因敲除技術(shù)已證明在肺部炎癥時(shí)，Egr-1的活化與TNF-α的表達(dá)直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Egr-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組小鼠Egr-1表達(dá)較糖尿病組明顯增強(qiáng)，TNF-α和ICAM-1的表達(dá)也均強(qiáng)于糖尿病組，而Egr-1 siRNA轉(zhuǎn)染組Egr-1表達(dá)明顯受抑制，TNF-α和ICAM-1的表達(dá)與糖尿病組相比也均明顯下降，證明Egr-1通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α、ICAM-1等因子的表達(dá)，使腎臟細(xì)胞增殖及組織局部單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，分泌細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、活性氧自由基、一氧化氮和金屬蛋白酶等加速腎小球硬化，進(jìn)而在DN炎癥損害和纖維化中起到了重要作用，但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

Figure 3.The protein expression of Egr-1，TNF-α and ICAM-1 in the renal tissue of all groups detected by Western blot.＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05 vs diabetic.圖3各組小鼠腎組織Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)

總之，目前對(duì)Egr-1具體的生物學(xué)功能尚不清楚，探討Egr-1高表達(dá)對(duì)腎小球系膜細(xì)胞TNF-α、ICAM-1的表達(dá)及系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積的影響，對(duì)進(jìn)一步明確Egr-1在糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制具有重要意義，將為臨床提供糖尿病腎病早期干預(yù)的新靶點(diǎn)，為人類(lèi)防治糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯:陳妙玲，羅森)

·短篇論著·

Effect of Egr-1 gene transfection on renal inflammation in diabetic mice

LIU Jie1，ZHANG Hai-song2，MA Yong-jun4，LIU Li5，HOU Ming-hui1，WANG Hongjie3，YANG Hui4
(1Department of Endocrinology，2Department of Nephrology，3Department of Research，Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China;4Department of Tumor＆Endocrinology，Mancheng County Hospital，Mancheng 072150，China;5Department of Pediatrics，Baoding First Hospital，Baoding 071000，China.E-mail: hdfyzhs1665@sina.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effects of Egr-1 gene transfection on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)，and to investigate the role of Egr-1 in the pathogenesis of diabetic nephropathy.METHODS: The diabetic mouse model was established.Ten mice were randomly selected as the diabetic group.The remaining 40 mice were injected with empty plasmid，Egr-1 expression plasmid or Egr-1 siRNA plasmid via the tail vein once a week.The normal control group was also set up.The animals were sacrificed at the end of the 4th week.The renal tissues were harvested.The expressions of Egr-1，TNF-α and ICAM-1 were detected by immunohistochemistry and Western blot.The pathological changes were observed under electron microscope.RESULTS: In diabetic mouse kidney，the expression of Egr-1，TNF-α and ICAM-1 was increased，and irregular thickening of glomerular basement membrane，mesangial expansion and fusion of foot were observed.The change trend was more significant in Egr-1 gene transfection group，and these changes in siRNA plasmid transfection group were obviously reduced compared with diabetes group.CONCLUSION: Egr-1 up-regulates the expression of TNF-α and ICAM-1，and induces mesangial cell proliferation and mesangial extracellular matrix accumulation，which is probably one of the mechanisms of accelerating glomerulosclerosis.

［KEY WORDS］Early growth response protein 1; Gene transfection; Diabetic nephropathies; Tumor necrosis factor-α; Intercellular adhesion molecule-1

通訊作者△Tel: 0312-5981012; E-mail: hdfyzhs1665@sina.com

*［基金項(xiàng)目］保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(No.13ZF115)

［收稿日期］2015-02-12［修回日期］2015-07-20

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)09-1688-05

［中圖分類(lèi)號(hào)］R392.11; R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.028