魏美林,王倩倩,李 旭,韓峻峰,魏 麗

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科,上海市糖尿病臨床醫(yī)學(xué)中心,上海市糖尿病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市糖尿病研究所,上海 200233)

胰島素瘤是最常見的胰腺內(nèi)分泌腫瘤,占后者總數(shù)的70%～80%,發(fā)病率約為4/100萬;其中女性約占60%。絕大多數(shù)胰島素瘤為良性,惡性比例約占10%[1?3];通常表現(xiàn)為單個(gè)散在的腫瘤,直徑常＜2cm[4,5],病理表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞形成的腺瘤或者癌。由于胰島素不適當(dāng)?shù)姆置?臨床上常導(dǎo)致患者反復(fù)發(fā)作低血糖,對患者的危害極大。手術(shù)切除腫瘤是唯一的根治性治療方法[6]。目前胰島素瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,進(jìn)一步深入研究胰島素瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的意義。

GATA6是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員,位于18q11.1→q11.2,全長33.1kb,可識別并結(jié)合多個(gè)基因的啟動子區(qū)的A/TGATAA/G序列從而發(fā)揮調(diào)控的作用[7]。GATA6參與體內(nèi)多種細(xì)胞組織的分化過程,對心臟、胃腸道及胰腺等組織的發(fā)育具有關(guān)鍵的作用[8,9]。除參與細(xì)胞的分化,GATA6與細(xì)胞的增殖和凋亡也密切相關(guān)。近來有研究表明,GATA6的異常表達(dá)參與體內(nèi)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10,11]。然而迄今為止,GATA6與胰島素瘤的關(guān)系未見研究報(bào)道,因此我們設(shè)計(jì)了本試驗(yàn),旨在探討GATA6在胰島素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 胰島素瘤及正常胰腺組織標(biāo)本的來源與制備

收集2009年1月至2014年9月在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院行胰島素瘤手術(shù)切除的3例患者的手術(shù)標(biāo)本及其臨床資料,其中男性1例、女性2例,年齡分別為32歲、51歲及56歲。手術(shù)標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)為胰島素瘤,取腫瘤中間組織為瘤體組織,術(shù)中游離的腫瘤邊界組織為瘤旁組織,采用液氮保存。蛋白印跡法(Western blotting)試驗(yàn)中,3例胰島素瘤瘤體組織作為試驗(yàn)組,自身瘤旁組織作為對照組。另外,在免疫熒光試驗(yàn)中,為了與正常胰腺組織內(nèi)的胰島β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及GATA6的表達(dá)定位對比,收集2例正常胰腺組織,標(biāo)本取自因其他原因行胰腺部分切除的非腫瘤患者,且經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。免疫熒光試驗(yàn)中將3例胰島素瘤標(biāo)本及2例正常胰腺組織標(biāo)本置于10%甲醛(福爾馬林)溶液固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片。標(biāo)本的收集及使用均通過上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)且經(jīng)患者同意使用。

1.2 主要試劑

小鼠胰島素瘤細(xì)胞系MIN6細(xì)胞(上海市糖尿病研究所);針對小鼠GATA6基因干擾的小干擾RNA(siRNA),(Life technologies公司,美國),GATA6 siRNA正義鏈:5'-CAAAAAUACUUCUCCUUCUtt-3',反義鏈:5'-AGAAGGAGAAGUAUUUUUGgt-3';陰性siRNA(negative siRNA;Life technologies公司,美國),與已知的小鼠基因沒有同源性。siRNA轉(zhuǎn)染試劑采用RNAiMax試劑(Invitrogen公司,美國),GATA6抗體(貨號ab22600;Abcam公司,英國)、甘油醛?3?磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(貨號Ap0063;Bioworld公司,美國);胰島素抗體(貨號ab7842;Abcam公司,英國)、高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、0.25%的胰酶、青鏈霉素雙抗(Gibco公司,美國),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(Promega公司,美國)。Alexa fluor 488及Alexa fluor 594熒光二抗(Life Technologies公司,美國),流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司,美國),Annexin-PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Life Technologies公司,美國)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Western blotting檢測GATA6的表達(dá) 蛋白裂解液提取組織或者細(xì)胞的總蛋白,離心后取上清,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)檢測蛋白濃度后上樣,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂牛奶封閉,1:1000稀釋GATA6的一抗,1∶5000稀釋的內(nèi)參GAPDH一抗,4℃孵育過夜,洗膜3次后室溫孵育二抗90min。最后用電化學(xué)發(fā)光顯色、曝光,Gel-pro軟件分析灰度值,并計(jì)算相對密度。

1.3.2 組織切片免疫熒光 石蠟防脫片經(jīng)過二甲苯脫蠟處理,梯度乙醇復(fù)水,檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù),0.3%的聚乙二醇辛基苯基醚(tritonX-100)通透,BSA封閉,滴加適宜濃度的GATA6及胰島素一抗混合液,放置于濕盒中4℃孵育過夜,一抗孵育完畢后滴加熒光二抗混合液于濕盒中室溫避光孵育1～1.5h,4,6?二脒基?2?苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核,抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照,并使用Image J軟件進(jìn)行圖片重疊(Merge)觀察GATA6在胰島素瘤及人正常胰腺胰島中的表達(dá)及定位。

1.3.3 MIN6細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 小鼠胰島素瘤細(xì)胞系MIN6細(xì)胞培養(yǎng)采用含15% FBS及50μmol/L β巰基乙醇的高糖DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)行常規(guī)培養(yǎng)。MIN6細(xì)胞貼壁性好,6～8h內(nèi)即可完全貼壁。細(xì)胞接種至12孔板中,待細(xì)胞長至70%～80%時(shí),使用RNAiMax試劑轉(zhuǎn)染。將接種細(xì)胞分為兩組,(1)對照組:轉(zhuǎn)染陰性siRNA;(2)試驗(yàn)組:轉(zhuǎn)染GATA6 siRNA。轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[12],轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RTQ-PCR)驗(yàn)證siRNA的干擾效果。

1.3.4 RTQ-PCR檢測GATA6的表達(dá) 引物設(shè)計(jì)由上海生工生物工程公司合成;小鼠GATA6及內(nèi)參β-actin引 物 序 列 分 別 為 GATA6-F:5'-CAACCTCGGTTATCCCAGAA-3';GATA6-R:5'-GACCTCAGATCAGCCACGTT-3';β-actin-F :5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3';β-actin-R :5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。MIN6細(xì)胞分為兩組,對照組轉(zhuǎn)染陰性siRNA,試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染GATA6 siRNA,轉(zhuǎn)染48h后,棄去培養(yǎng)液,采用常規(guī)方法提取總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成cDNA,再進(jìn)行熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞GATA6 mRNA的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性30s,95℃變性5s,60℃退火20s,循環(huán)40次;擴(kuò)增完畢后進(jìn)行溶解曲線分析,以確定反應(yīng)產(chǎn)物的單一性。試驗(yàn)結(jié)束時(shí),機(jī)器自動給出每個(gè)樣品的循環(huán)閾值(Ct值)。每組樣品重復(fù)測量3次,各組比較采用2?△△Ct計(jì)算基因的相對表達(dá)量,△△Ct＝[(試驗(yàn)組GATA6的Ct值-試驗(yàn)組β-actin的Ct值)-(對照組GATA6的Ct值-對照組β-actin的Ct值)]。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)MIN6細(xì)胞分為兩組,對照組轉(zhuǎn)染陰性siRNA,試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染GATA6 siRNA,轉(zhuǎn)染48h后,0.25%胰酶消化細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌懸浮并計(jì)數(shù),吸取1×105個(gè)細(xì)胞使用膜聯(lián)蛋白(annexin)結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞,每管加入5μl的Annexin V-fluor488 及 100μg/ml的 碘 化 丙 啶(propidium iodide,PI)染色液1μl,室溫避光孵育后流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 MIN6細(xì)胞分為兩組,對照組轉(zhuǎn)染陰性siRNA,試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染GATA6 siRNA,轉(zhuǎn)染48h后,使用0.25%的胰酶消化細(xì)胞,用提前預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞,RNase-A水浴去除RNA,加入適宜濃度PI染色液避光孵育后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以±s表示;兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰島素瘤瘤體及瘤旁組織GATA6的表達(dá)水平比較

為了明確GATA6在胰島細(xì)胞瘤瘤體及瘤旁表達(dá)水平的差異,取3例胰島素瘤的瘤體及瘤旁組織通過Western blotting進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)GATA6在胰島素瘤瘤體組織表達(dá)較瘤旁組織顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖1)。

圖1 胰島素瘤瘤體及瘤旁組織GATA6蛋白表達(dá)差異Figure 1 The different expression level of GATA6 protein in insulinoma and para-insulinoma tissue

2.2 胰島素瘤及正常胰腺組織的GATA6免疫熒光

為了進(jìn)一步明確GATA6在胰島素瘤及人正常胰腺胰島中的表達(dá)及定位,通過免疫熒光將胰島素及GATA6進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記。紅色標(biāo)記胰島素陽性細(xì)胞即胰島β細(xì)胞,綠色標(biāo)記GATA6陽性細(xì)胞,藍(lán)色DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。胰島素瘤組織切片免疫熒光顯示,胰島素瘤瘤體正常胰島結(jié)構(gòu)喪失,胰島素染色呈陽性,三者免疫熒光重疊(Merge)后提示GATA6主要定位于細(xì)胞核中,在胰島素瘤中大量表達(dá),在人正常胰腺切片胰島β細(xì)胞中少量表達(dá)(圖2)。

2.3 siRNA干擾MIN6細(xì)胞中GATA6表達(dá)的效果驗(yàn)證

MIN6細(xì)胞分兩組,對照組轉(zhuǎn)染陰性siRNA,試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染GATA6 siRNA,轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行RTQ-PCR驗(yàn)證,結(jié)果提示GATA6 siRNA可有效減少GATA6 mRNA表達(dá)水平。siRNA可使GATA6 mRNA表達(dá)減少85%,干擾效果顯著(P＜0.05;圖3)。

圖2 胰島素瘤及正常人胰島組織切片免疫熒光Figure 2 Immunofluorescence analysis of GATA6 and insulin in insulinoma tissue and normal pancreatic tissue slice(×200)

圖3 siRNA干擾對GATA6 mRNA表達(dá)的影響Figure 3 Effect of siRNA interference against GATA6 mRNA expression

2.4 siRNA干擾GATA6表達(dá)后MIN6細(xì)胞凋亡顯著增加

為了進(jìn)一步觀察GATA6在胰島素瘤細(xì)胞中的作用,將MIN6細(xì)胞分兩組,對照組轉(zhuǎn)染陰性siRNA,試驗(yàn)組[16,17]轉(zhuǎn)染GATA6 siRNA,轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行AnnexinV-PI標(biāo)記,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測,重復(fù)3次。siRNA干擾GATA6表達(dá)后,細(xì)胞凋亡較對照組顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖4)。

2.5 GATA6對胰島素瘤細(xì)胞增殖的影響

為了證實(shí)GATA6對胰島素瘤細(xì)胞增殖的影響,培養(yǎng)MIN6細(xì)胞分為兩組,分別轉(zhuǎn)染陰性siRNA及GATA6 siRNA,轉(zhuǎn)染48h后對細(xì)胞進(jìn)行固定及PI標(biāo)記,上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析,重復(fù)3次。干擾GATA6表達(dá)后,G0/G1期細(xì)胞較對照組升高,但未出現(xiàn)明顯的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的G0/G1期阻滯(P＝0.13)。然而,GATA6 siRNA沉默GATA6表達(dá)后,處在S期的細(xì)胞與對照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示干擾GATA6表達(dá)后對細(xì)胞的增殖起一定的抑制作用(圖5)。

3 討 論

在哺乳動物中,GATA鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族包含6個(gè)成員,分別為GATA1～6,有研究表明GATA1、GATA2及GATA3參與造血干細(xì)胞的分化,而GATA4、GATA5及GATA6則控制著中胚層及內(nèi)胚層來源細(xì)胞的分化[13,14]。GATA4以及GATA6在早期胰腺上皮細(xì)胞中重疊表達(dá),但后期分化過程中,GATA4僅存在于胰腺的外分泌細(xì)胞中,而GATA6則表達(dá)于胰腺的內(nèi)分泌細(xì)胞中[9]。GATA6在體內(nèi)廣泛表達(dá),可表達(dá)于心肌、胃腸道及胰腺等組織中。除胰?十二指腸同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX1)和Ptf1a等常見的轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞的發(fā)育,GATA6還可作用于另外一種胰腺分化過程中必需的轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.2[15],從而對胚胎中胰腺細(xì)胞的分化起重要的作用。GATA6基因突變可引起心臟先天性畸形、胰腺發(fā)育不全、內(nèi)分泌腺及外分泌腺功能消失[16,17],雜合的GATA6突變可引起糖尿病的多種異常表型,包括胰腺發(fā)育不全,成人起病的糖尿病,伴或者不伴有外分泌功能的缺失[18],提示GATA6在胰腺中具有重要的作用。除與細(xì)胞的分化密切相關(guān)外,近來有研究表明GATA6異常表達(dá)參與體內(nèi)一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展,過表達(dá)GATA6可促進(jìn)MKN28胃癌細(xì)胞的增殖[10];亦有研究發(fā)現(xiàn)GATA6可通過抑制Wnt信號通路的拮抗劑Dickkopf-1從而激活Wnt信號通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖[19]。我們研究發(fā)現(xiàn)GATA6在胰島素瘤表達(dá)水平較瘤旁顯著升高,主要定位于細(xì)胞核中,沉默GATA6基因表達(dá)后細(xì)胞凋亡顯著增加,并且胰島素瘤細(xì)胞的增殖受抑制,提示GATA6可能在腫瘤的形成中發(fā)揮重要的作用。

GATA6在胰島β細(xì)胞中可能具有重要的作用,Cnop等[20]研究證實(shí),大鼠原代β細(xì)胞及人原代β細(xì)胞用siRNA沉默GATA6基因的表達(dá)后,大鼠原代β細(xì)胞及人β細(xì)胞較對照組發(fā)生顯著的凋亡;如應(yīng)用siRNA沉默GATA6表達(dá)后再給予棕櫚酸作用,大鼠原代β細(xì)胞及人原代β細(xì)胞將發(fā)生更大程度的凋亡。結(jié)果提示GATA6與β細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),其機(jī)制可能與GATA轉(zhuǎn)錄因子具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整性及胰島β細(xì)胞的生存有關(guān)[21]。腫瘤細(xì)胞的數(shù)量不僅取決于腫瘤的增殖速率,也取決于腫瘤細(xì)胞的凋亡速率。同樣對于胰島素瘤而言,其數(shù)量也是由腫瘤細(xì)胞新生及凋亡共同決定的,抗凋亡機(jī)制的獲得可能會改變胰島素瘤增殖及凋亡的比例,從而參與胰島素瘤的發(fā)生發(fā)展。我們的試驗(yàn)證實(shí)GATA6在胰島素瘤中異常高表達(dá),干擾胰島素瘤細(xì)胞GATA6表達(dá)后細(xì)胞凋亡顯著增加,提示GATA6在胰島素瘤中可能具有抗凋亡作用。有研究表明在一種心肌細(xì)胞中過表達(dá)GATA6后可抵抗高劑量胰島素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡[22];在另一研究中GATA6在食管腺癌中異常高表達(dá),利用特異性的siRNA沉默GATA6的表達(dá)后抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著減少,細(xì)胞凋亡顯著增加[23]。GATA6不僅參與

細(xì)胞的凋亡,且與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。Chen等[24]研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中GATA6的表達(dá)異常增加,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步利用胰腺癌細(xì)胞系SW1990細(xì)胞沉默GATA6的表達(dá)后,癌細(xì)胞凋亡增加,且細(xì)胞的增殖顯著受抑制。

圖4 siRNA干擾MIN6細(xì)胞GATA6表達(dá)對凋亡的影響Figure 4 Effect of siRNA interference against GATA6 expression on apoptosis of MIN6 cell

圖5 siRNA干擾GATA6表達(dá)對MIN6細(xì)胞分裂周期的影響Figure 5 Effect of siRNA interference against GATA6 expressionon MIN6 cell cycle

綜上所述,本研究表明,GATA6在胰島素瘤中異常高表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的凋亡及增殖密切相關(guān)。GATA6可能在胰島素瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用,有望成為胰島素瘤患者新的治療干預(yù)靶點(diǎn)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Service FJ,McMahon MM,O’Brien PC,et al.Functioning insulinoma—incidence,recurrence,and long-term survival of patients:a 60-year study[J].Mayo Clin Proc,1991,66(7):711?719.

[2]Fendrich V,Waldmann J,Bartsch DK,et al.Surgical management of pancreatic endocrine tumors[J].Nat Rev Clin Oncol,2009,6(7):419?428.

[3]Han JF,Zhang F,Bao YQ,et al.Diagnostic value of parameters of glucose metabolism as screening tests for insulinoma[J].Natl Med J China,2010,90(16):1093?1096.[韓峻峰,張 鋒,包玉倩,等.糖代謝相關(guān)指標(biāo)對診斷胰島素瘤的臨床價(jià)值[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2010,90(16):1093?1096.]

[4]Grant CS.Insulinoma[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol,2005,19(5):783?798.

[5]Abboud B,Boujaoude J.Occult sporadic insulinoma:localization and surgical strategy[J].World J Gastroenterol,2008,14(5):657?665.

[6]Pl?ckinger U,Rindi G,Arnold R,et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of neuroendocrine gastrointestinal tumours.A consensus statement on behalf of the European Neuroendocrine Tumour Society(ENETS)[J].Neuroendocrinology,2004,80(6):394?424.

[7]Patient RK,McGhee JD.The GATA family(vertebrates and invertebrates)[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12(4):416?422.

[8]Zhao R,Watt AJ,Battle MA,et al.Loss of both GATA4 and GATA6 blocks cardiac myocyte differentiation and results in acardia in mice[J].Dev Biol,2008,317(2):614?619.

[9]Decker K,Goldman DC,Grasch CL,et al.Gata6 is an important regulator of mouse pancreas development[J].Dev Biol,2006,298(2):415?429.

[10]Wang H,Liu Z,Li J,et al.ΔNp63α mediates proliferation and apoptosis in human gastric cancer cells by the regulation of GATA-6[J].Neoplasma,2012,59(4):416?423.

[11]Lindholm PM,Soini Y,Myll?rniemi M,et al.Expression of GATA-6 transcription factor in pleural malignant mesothelioma and metastatic pulmonary adenocarcinoma[J].J Clin Pathol,2009,62(4):339?344.

[12]Moore F,Cunha DA,Mulder H,et al.Use of RNA interference to investigate cytokine signal transduction in pancreatic beta cells[J].Methods Mol Biol,2012,820:179?194.

[13]Bresnick EH,Lee HY,Fujiwara T,et al.GATA switches as developmental drivers[J].J Biol Chem,2010,285(41):31087?31093.

[14]Molkentin JD.The zinc finger-containing transcription factors GATA-4,-5,and -6.Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression[J].J Biol Chem,2000,275(50):38949?38952.

[15]Sussel L,Kalamaras J,Hartigan-O’ Connor DJ,et al.Mice lacking the homeodomain transcription factor Nkx2.2 have diabetes due to arrested differentiation of pancreatic beta cells[J].Development,1998,125(12):2213?2221.

[16]Chao CS,McKnight KD,Cox KL,et al.Novel GATA6 mutations in patients with pancreatic agenesis and congenital heart malformations[J].PLoS One,2015,10(2):e0118449.

[17]Lango Allen H,Flanagan SE,Shaw-Smith C,et al.GATA6 haploinsufficiency causes pancreatic agenesis in humans[J].Nat Genet,2012,44(1):20?22.

[18]De Franco E,Shaw-Smith C,Flanagan SE,et al.GATA6 mutations cause a broad phenotypic spectrum of diabetes from pancreatic agenesis to adult-onset diabetes without exocrine insufficiency[J].Diabetes,2013,62(3):993?997.

[19]Zhong Y,Wang Z,Fu B,et al.GATA6 activates Wnt signaling in pancreatic cancer by negatively regulating the Wnt antagonist Dickkopf-1[J].PLoS One,2011,6(7):e22129.

[20]Cnop M,Abdulkarim B,Bottu G,et al.RNA sequencing identifies dysregulation of the human pancreatic islet transcriptome by the saturated fatty acid palmitate[J].Diabetes,2014,63(6):1978?1993.

[21]Sartori DJ,Wilbur CJ,Long SY,et al.GATA factors promote ER integrity and beta-cell survival and contribute to type 1 diabetes risk[J].Mol Endocrinol,2014,28(1):28?39.

[22]Li WY,Song YL,Xiong CJ,et al.Insulin induces proliferation and cardiac differentiation of P19CL6 cells in a dose-dependent manner[J].Dev Growth Differ,2013,55(7):676?686.

[23]Lin L,Bass AJ,Lockwood WW,et al.Activation of GATA binding protein 6(GATA6)sustains oncogenic lineage-survival in esophageal adenocarcinoma[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(11):4251?4256.

[24]Chen WB,Huang FT,Zhuang YY,et al.Silencing of GATA6 suppresses SW1990 pancreatic cancer cell growthin vitroand up-regulates reactive oxygen species[J].Dig Dis Sci,2013,58(9):2518?2527.