劉 軍,甄 平,李旭升,李慎松,田 琦,常彥峰,高展望,張航向,陳 慧*

(1蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍骨科中心,蘭州 730050;2第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科,西安 710032)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以局部關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形為臨床特征,致使患者活動能力受限的慢性關(guān)節(jié)軟骨退行性病變[1],可導(dǎo)致軟骨下骨質(zhì)增生,進而嚴(yán)重影響日常工作和生活。其在＞65歲的老年人中發(fā)病率日趨增高,據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報道,65～70歲的老年人OA的患病率接近62%,＞70歲的人群中接近70%[2]。我國老齡化社會的快速到來將使我國成為世界上OA患病人數(shù)最多的國家之一。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和全民醫(yī)保的覆蓋,OA患者的生活和生存狀況更加受到重視。持續(xù)的軟骨細(xì)胞凋亡、滑膜炎和骨破壞等致使OA患者病情進行性加重,面臨的選擇只有人工膝關(guān)節(jié)表面置換手術(shù)。

Janus酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子蛋白(Janus activated tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路家族。JAK家族成員包括JAK1、JAK2、JAK3、和酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2),主要存在于人體細(xì)胞質(zhì)中,與同在細(xì)胞質(zhì)中的STAT家族的7個成員(包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6)共同參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷和凋亡等密切相關(guān)的重要通路[3]。

本實驗主要通過JAK2/STAT3信號通路與OA中軟骨細(xì)胞凋亡的相關(guān)性以及其對軟骨細(xì)胞線粒體抗氧化應(yīng)激能力影響的研究,為臨床中西醫(yī)治療OA提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

C57BL/6小鼠(雄性,10只,體質(zhì)量10.25～15.70g,平均12.55g)由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供;還包括SC-39100(JAK2/STAT3通路激動劑)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司,美國);蛋白酶抑制劑、p-JAK2抗體、p-STAT3抗體、β-激動蛋白(β-actin)抗體(Santa Cruz公司,美國);下丘腦調(diào)節(jié)性多肽(hypothalamic regulatory peptides,HRP);羊抗小鼠、羊抗兔和兔抗羊IgG二抗(北京中杉金橋公司);改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)低糖培養(yǎng)液(Hyclone公司,美國);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,杭州四季青公司);無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基(RPMI1640;Gibco公司,美國);RIPA蛋白質(zhì)裂解液(Promab公司,美國);蛋白上樣緩沖液(上海碧云天生物公司);線粒體提取盒(武漢博士德生物公司)。

1.2 實驗小鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型制備

將10只小鼠隨機分為兩組,每組5只。任選一組小鼠腹腔麻醉后,乙醇消毒,于解剖顯微鏡下進行無菌手術(shù)操作。用眼科剪沿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向剪開皮膚、黏膜(避免剪斷附著于黏膜上的血管),使內(nèi)側(cè)副韌帶暴露;換用維納斯剪在視野中央的內(nèi)側(cè)副韌帶做一小切口,在內(nèi)側(cè)副韌帶切口處劃斷半月板上下緣的關(guān)節(jié)囊,用神經(jīng)剝離子鉤出內(nèi)側(cè)半月板并剪斷,切口留下剪斷的內(nèi)側(cè)副韌帶及半月板;消毒后依次進行縫合作為實驗組(OA模型組),另外1組5只正常生長的小鼠做為對照組。3周后同時脫頸處死OA模型組和對照組小鼠,并分別提取兩組膝關(guān)節(jié)組織待用。

1.3 軟骨細(xì)胞提取及培養(yǎng)

將分別分離的兩組小鼠的膝關(guān)節(jié)滑膜組織置于培養(yǎng)瓶中,再分別放置于1mg/ml膠原酶Ⅰ的HEPES液(4-羥乙基哌嗪乙磺酸、MgSO40.8mmol/L、NaCl 116.0mmol/L、KC1 5.4mmol/L、NaH2PO410.0mmol/L、葡萄糖5.1mmol/L,pH7.3)中消化,重復(fù)消化3次,每次3～5min。用含10%血清的DMEM溶液終止消化,置于低速離心機中以1000轉(zhuǎn)/min進行離心5min。棄去上清液,用含10%血清和0.01mmol/L的DMEM溶液重懸細(xì)胞。用篩網(wǎng)(200目)過濾沒有貼壁的細(xì)胞,去除未消化的組織塊。收集過濾的細(xì)胞懸液,進行細(xì)胞計數(shù),按照實驗要求種入不同的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中。

1.4 實驗細(xì)胞分組

對照組和實驗組(OA模型組)分別取對數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔2×105/ml接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行孵育,24h內(nèi)細(xì)胞達到80%～90%融合后,用含體積分?jǐn)?shù)0.01%FBS的DMEM孵育細(xì)胞24h,使細(xì)胞同步化。觀察JAK2/STAT3通路各指標(biāo)在上述兩組中的表達,并在兩組中加入JAK2/STAT3通路激動劑以觀測相關(guān)指標(biāo)的變化;同時觀察兩組小鼠線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)表達情況。本實驗共分為4組:對照組(細(xì)胞取自正常生長小鼠);OA模型組(細(xì)胞取自實驗組小鼠);OA模型＋SC-39100組(細(xì)胞取自實驗組小鼠加SC-39100激動劑);對照＋SC-39100組(細(xì)胞取自正常生長小鼠加SC-39100激動劑)。

1.5 蛋白印跡法檢測p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白表達

將裂解后的細(xì)胞懸液置于4℃低溫離心機中離心15min,12 000轉(zhuǎn)/min。取離心后上清液,一部分用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法進行蛋白定量,另一部分按照4∶1的體積比加入上樣緩沖液,沸水中煮7min。蛋白印跡法(Western blotting)檢測的具體方法為取30μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳,并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane,NC膜)上。根據(jù)預(yù)染Marker提示,將NC膜按照分子量剪成不同條帶,用含有p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白、Bax蛋白和β-actin(1∶1000)一抗的洗滌緩沖液(Tris buffered saline with Tween,TBST)4℃孵育過夜。過夜后,用TBST溶液搖床洗3次,每次10min。然后用1:5000的對應(yīng)二抗孵育條帶2h。再次TBST搖床洗3次后用電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence,ECL)液進行曝光顯影,Bio-Rad照相系統(tǒng)拍照,并用所帶電腦軟件進行條帶灰度值的分析。

1.6 Western blotting檢測琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素c氧化酶蛋白表達

分別用線粒體提取試劑盒提取不同實驗分組的線粒體,再用Western blotting檢測線粒體氧化應(yīng)激指標(biāo)琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)和細(xì)胞色素c氧化酶(cytochromec oxidase,COX),方法同1.5。

1.7 線粒體中丙二醛的測定

軟骨細(xì)胞接種、用藥處理步驟同1.3及1.4項。以0.25%的胰酶消化、收集細(xì)胞,待超聲波打碎細(xì)胞后,根據(jù)試劑盒說明書加入檢測試劑,用721分光光度計測定吸光度值(A),用考馬斯亮藍(lán)法進行蛋白質(zhì)定量測定,校正計算丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析,所有實驗數(shù)據(jù)均以±s 表示,計量資料采用t檢驗進行組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 檢測各組軟骨細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3表達水平

與對照組比較,OA模型組p-JAK2和p-STAT3的表達水平偏低(P＜0.05),表明OA模型組中JAK2/STAT3信號通路受到抑制;與OA模型組比較,OA＋SC-39100組可顯著增加p-JAK2和p-STAT3的表達水平(P＜0.05);對照+SC-39100組與OA＋SC-39100組比較,p-JAK2和p-STAT3的表達水平偏低(P＜0.05);對照＋SC-39100組與對照組比較,兩組p-JAK2和p-STAT3的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05;圖1,圖2)。

2.2 檢測各組軟骨細(xì)胞Bcl-2蛋白表達水平

與對照組比較,OA模型組Bcl-2蛋白的表達水平偏低(P＜0.05),表明OA模型組中軟骨細(xì)胞凋亡水平增高;與OA模型組比較,OA＋SC-39100組可顯著增加Bcl-2蛋白的表達水平(P＜0.05),表明加入JAK2/STAT3信號通路激動劑后,抑凋亡水平升高;對照＋SC-39100組與OA＋SC-39100組比較,Bcl-2蛋白的表達水平偏低(P＜0.05);對照＋SC-39100組與對照組比較,兩組Bcl-2蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,圖3)。

2.3 檢測各組軟骨細(xì)胞Bax蛋白表達水平

與對照組比較,OA模型組Bax蛋白的表達水平偏高(P＜0.05),表明OA模型組中軟骨細(xì)胞凋亡水平增高;與OA模型組比較,OA＋SC-39100組的Bax蛋白的表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),表明SC-39100可顯著降低Bax蛋白的表達水平,抑制軟骨細(xì)胞凋亡;OA＋SC-39100組與對照＋SC-39100組比較,Bax蛋白的表達水平偏高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);對照＋SC-39100組與對照組比較,兩組Bax蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,圖4)。

圖1 各組軟骨細(xì)胞p-JAK2的表達水平Figure 1 The expression of p-JAK2 in cartilage cells of each group

圖2 各組軟骨細(xì)胞p-STAT3的表達水平Figure 2 The expression of p-STAT3 in cartilage cells of each group

圖3 各組軟骨細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達水平Figure 3 The expression of Bcl-2 in cartilage cells of each group

圖4 各組軟骨細(xì)胞Bax蛋白的表達水平Figure 4 The expression of Bax in cartilage cells of each group

2.4 檢測各組軟骨細(xì)胞線粒體中SDH和COX表達水平

與對照組比較,OA模型組SDH和COX的表達水平偏低(P＜0.05),表明OA模型組中線粒體抗氧化應(yīng)激能力下降;與OA模型組比較,OA＋SC-39100組SDH和COX的表達水平顯著增加(P＜0.05),提示加入JAK2/STAT3信號通路激動劑后,軟骨細(xì)胞線粒體抗氧化應(yīng)激能力提高;與OA＋SC-39100組比較,對照＋SC-39100組中SDH和COX的表達水平偏低(P＜0.05);對照＋SC-39100組與對照組比較,兩組的SDH和COX的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05;圖5,圖6)。

圖5 各組軟骨細(xì)胞線粒體中SDH的表達Figure 5 The expression of SDH in cartilage cells mitochondria of each group

圖6 各組軟骨細(xì)胞線粒體中COX的表達水平Figure 6 The expression of COX in cartilage cells mitochondria of each group

2.5 測定各組軟骨細(xì)胞線粒體MDA表達水平

與對照組比較,OA模型組的MDA含量偏高(P＜0.05),表明OA模型組中線粒體氧化應(yīng)激損傷增加;與OA模型組比較,OA＋SC-39100組MDA的含量顯著降低(P＜0.05),提示加入JAK2/STAT3信號通路被激活后,軟骨細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷受到抑制;OA＋SC-39100組與對照＋SC-39100組比較,OA＋SC-39100組的MDA的含量偏高(P＜0.05);對照＋SC-39100組與對照組比較,MDA的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05;圖7)。

圖7 各組軟骨細(xì)胞線粒體MDA的含量Figure 7 The mitochondrial MDA content in cartilage cells of each group

3 討 論

OA是一種嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量和危害老年人健康的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病[4]。在全球最常見的三大老年性疾病——腦血管疾病、骨質(zhì)疏松癥和老年性骨關(guān)節(jié)病中位居首位[5]。隨著老年人群的壽命延長和對生活質(zhì)量要求的提高,OA已得到全社會的重視。我科近年來收治的大量OA患者中絕大多數(shù)唯一的治療方式為單膝或雙膝人工關(guān)節(jié)表面置換手術(shù),因而,我們嘗試從機制上對OA加以研究,以期為探索OA的發(fā)生發(fā)展和臨床治療提供新的解決思路。

本實驗中我們建立小鼠OA模型后,進行軟骨細(xì)胞分組檢測JAK2/STAT3信號通路相關(guān)指標(biāo)p-JAK2、p-STAT3,細(xì)胞凋亡指標(biāo)Bcl-2蛋白、Bax蛋白以及線粒體氧應(yīng)激指標(biāo)SDH和COX,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,OA模型組中p-JAK2和p-STAT3表達偏低(P＜0.05);但當(dāng)加入JAK2/STAT3信號通路激動劑SC-39100后,OA＋SC-39100組中p-JAK2和p-STAT3表達增高,與對照組和OA模型組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與對照組相比,OA模型組中抑制凋亡的Bcl-2蛋白表達水平偏低(P＜0.05),凋亡指標(biāo)Bax蛋白表達水平偏高,表明OA模型組中軟骨細(xì)胞凋亡明顯;OA＋SC-39100組中Bcl-2蛋白的表達增高、Bax蛋白的表達降低(P＜0.05),提示激活后的JAK2/STAT3信號通路可抑制軟骨細(xì)胞凋亡。SDH和COX均為抗氧化應(yīng)激的指標(biāo),MDA為過氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物,在OA模型組中,SDH和COX的表達均偏低(P＜0.05),而MDA的含量偏高(P＜0.05);在OA＋SC-39100組中SDH和COX的表達增加(P＜0.05),MDA的含量降低(P＜0.05),表明JAK2/STAT3信號通路的活化可緩解軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,維持線粒體功能,有利于軟骨細(xì)胞正常生長。

JAK/STAT信號通路家族對多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程有重要的調(diào)控作用[6]。Terrell等[7]發(fā)現(xiàn)炎癥因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)通過活化JAK/STAT信號通路促進心肌肥厚。Park等[8]發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路介導(dǎo)了氧化應(yīng)激引起的肺上皮細(xì)胞合成表面活性物質(zhì)的減少。Wen等[9]發(fā)現(xiàn)抑制JAK/STAT信號通路可以減輕缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)引起的腸黏膜細(xì)胞損傷和凋亡。腎臟疾病研究中發(fā)現(xiàn),血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)間接激活JAK/STAT通路,促進腎小球系膜細(xì)胞增生,從而導(dǎo)致糖尿病性腎病[10]。阻斷AngⅡ可阻止高血糖引起的JAK/STAT信號通路激活[11]。肝臟疾病的研究發(fā)現(xiàn),STAT的活化對于抗肝炎病毒感染、控制炎癥、修復(fù)損傷,和抗腫瘤發(fā)生都有重要意義[12]。臨床研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用抗IL-6受體抗體抑制STAT3的激活可改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)的炎癥反應(yīng)[13]。IL-l0通過STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)信號以發(fā)揮作用于巨噬細(xì)胞的抗炎作用[14]。Isomaki等[15]建立的RA動物模型研究報道STAT3功能失調(diào)會改變關(guān)節(jié)炎過程。

氧化應(yīng)激損傷參與多種疾病的發(fā)展進程,可導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷和死亡[16]。減輕氧化應(yīng)激損傷可以改善細(xì)胞功能狀態(tài),有利于細(xì)胞生長、增殖[17]。線粒體氧化損傷包括通透性改變、腫脹、氧化磷酸化解耦聯(lián)以及促凋亡蛋白的釋放[8]。近來的研究證實JAK2/STAT3信號通路的激活或抑制對氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能有顯著影響[18]。

綜上所述,OA的漸進性發(fā)展過程與JAK2/STAT3信號通路存在密切聯(lián)系,選擇特異性阻斷JAK2/STAT3信號通路是否是一個可行的防治OA的手段,值得我們進一步探索研究。

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