胥 威 盧永平

非綜合征性唇腭裂與TGFA基因rs 3771523位點(diǎn)SNP相關(guān)性的研究

胥 威 盧永平

目的 探討核心家庭中轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFA)rs 3771523位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)的關(guān)系。方法 166例NSCL/P患者, 患者父母271例, 核心家庭111個(gè)。采用芯片檢測基因型, 進(jìn)行家庭為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(FBAT)。結(jié)果 父母基因型分布未偏離HW平衡(P＞0.05)；NSCL/P核心家庭中rs 3771523等位基因G和等位基因A存在過低傳遞和過度傳遞。結(jié)論 TGFA基因rs 3771523等位基因A與NSCL/P的發(fā)生密切相關(guān)。

非綜合征性唇腭裂；家庭為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)；轉(zhuǎn)化生長因子α

唇腭裂是新生兒中最常見的一種先天性發(fā)育畸形, 通常分為綜合征性和非綜合征性。將不伴發(fā)其他系統(tǒng)器官畸形的唇腭裂稱為非綜合征性唇腭裂(nonsyndromic cleft lip and/or cleft palate, NSCL/P)［1］。大量的研究表明, NSCL/P是一種多基因遺傳病, 其易感基因位點(diǎn)具有異質(zhì)性。目前, 患者父母對(duì)照研究是復(fù)雜性疾病易感基因研究的一種新的設(shè)計(jì)方法,該方法采用患者及其父母為研究對(duì)象, 有效的避免了由于病例組和對(duì)照組間遺傳背景的差異而造成的虛假關(guān)聯(lián), 還可以進(jìn)行交互作用的分析。本研究以核心家庭為研究對(duì)象, 運(yùn)用家庭為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(family based association test, FBAT)分析了TGFA基因rs 3771523單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)和NSCL/P發(fā)生的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年1月～2012年7月收住于中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院的NSCL/P患者166例(病者組), 患者父母271例(父母組), 核心家庭(患者及雙親)111個(gè)。經(jīng)簽訂書面知情同意書后, 采集患者及父母外周血5 ml。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增、特異性引物延伸、芯片雜交及基因多態(tài)性檢測 用TIANamp血液DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系為20 μl, 含DNA模板2.5 ng、Ex Taq DNA聚合酶0.05 U、1×buffer、dNTP 0.125 mM及引物0.4 μM。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min后, 94℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 35個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物純化后, 進(jìn)行特異性引物延伸。體系為15 μl, 含純化產(chǎn)物5 μl、VentR(exo-)DNA聚合酶0.02 U、 dATP 0.375 μl、dTTP 0.375 μl、dGTP 0.375 μl、Cy3標(biāo)記的dCTP 0.375 μl、特異性延伸引物0.025 μM。延伸反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min后, 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸3 min。將混合雜交液的延伸產(chǎn)物同點(diǎn)有探針的芯片進(jìn)行雜交, 雜交條件為60℃ 1 h。清洗后, 掃描儀掃描芯片探針信號(hào), 讀取基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用家庭為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行FBAT分析；病者組與父母組基因型分別做Hardy-Weinberg(HW)平衡檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測結(jié)果 患者及父母基因型和等位基因分布情況及Hardy-Weinberg(HW)平衡檢驗(yàn)結(jié)果見表1。父母基因型分布未偏離HW平衡(P＞0.05)。

表1 基因型和等位基因分布情況及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 NSCL/P核心家庭FBAT檢驗(yàn)結(jié)果 rs 3771523等位基因G和等位基因A分別存在過低傳遞(P=0.019613, Z=-2.333)和過度傳遞現(xiàn)象(P=0.019613, Z=2.333)。

3 討論

轉(zhuǎn)化生長因子α屬于表皮生長因子家族, 在胚胎發(fā)育中有著重要的作用, 它可以刺激上皮細(xì)胞增生、誘導(dǎo)其分化。而唇腭裂的發(fā)生正是由于中間上皮細(xì)胞不能正常增生和分化, 從而導(dǎo)致發(fā)育中的面突不能正常融合。目前, 已發(fā)現(xiàn)了TGFA基因的356個(gè)SNP和20個(gè)插入/缺失與NSCL/P發(fā)病相關(guān)［2］, 但rs 3771523的研究極少。Machida等［3,4］分析了Marker2A(G3822A, C3827T, T3851C, A3879G)多態(tài)在日本NSCL/P患者和正常人之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 但單體型Marker 2A-6與NSCL/P發(fā)病密切相關(guān)(P=0.0086)。本研究采用以核心家庭為基礎(chǔ)的分析方法, 分析了TGFA基因rs 3771523位點(diǎn)SNP與NSCL/P的發(fā)生關(guān)系。結(jié)果顯示：NSCL/P核心家庭中rs 3771523等位基因G和等位基因A分別存在過低傳遞和過度傳遞現(xiàn)象, 說明TGFA基因rs 3771523等位基因A與NSCL/P的發(fā)生密切相關(guān)。

［1］ 馬堅(jiān), 黃永清, 馬敏, 等.中國西部人群IRF6基因V274I位點(diǎn)SNP與非綜合征型唇腭裂相關(guān)性的研究.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 24(3):417-421.

［2］ Vieira AR.Association between the transforming growth factor alpha gene and nonsyndromic oral clefts:a HuGE review.Am J Epidemiol, 2006, 163(9):790-810.

［3］ Machida J, Sato F, Kaetsu A, et al.Candidate genes for nonsyndromic cleft lip and palate.J Craniomaxillofac Sury, 2000, 28(suppl):50s.

［4］ Machida J, Yoshiura K, Funkhauser CD, et al.Transforming growth factor alpha(TGFA):genomic structure, boundary sequences, and mutation analysis in nonsyndromic cleft lip/palate and cleft palate only.Genomics, 1999, 61(3):237-242.

Research of correlation between non-syndromic cleft lip and/or palate and TGFA gene rs 3771523 locus SNP

XU Wei, LU Yong-ping.
Liaoning Provincial Research Institute of Family Planning, Shenyang 110000, China

Objective To explore the relationship between transforming growth factor α (TGFA) rs 3771523 locus single nucleotide polymorphism (SNP) and non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P) in nuclear families.Methods There were 166 NSCL/P patients, 271 parents, and 111 nuclear families.The genotypes were detected by microarray, and family-based association tests (FBAT) were performed.Results The genotype distribution of the parents was not diverged from HW balance (P＞0.05).In the NSCL/P nuclear families, over-transmission and under-transmission were found in rs 3771523 allele G and A.Conclusion There is a close relationship between TGFA gene rs 3771523 allele A and NSCL/P.

Non-syndromic cleft lip and/or palate; Family-based association tests; Transforming growth factor α

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.05.018

2014-09-29］

110031 遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院