張慶成，張向峰，汪承煒，代祥艷

武警上?？傟犪t(yī)院心血管內科，上海 201103

冠狀動脈支架置入術后支架內再狹窄(in-stent restenosis，ISR)是目前臨床最為常見的急性疾病之一，其危險性大，發(fā)病機制復雜多樣。血小板高反應性(HPR)主要是指通過標準抗血小板治療后，血小板仍然高度活化并大量聚集而引發(fā)血栓。血小板活化與聚集是各種動脈粥樣硬化血栓形成及冠狀動脈支架內血栓形成的病理生理基礎，即使經標準抗血小板治療，仍有部分冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)患者發(fā)生心血管血栓事件。其中，急性冠狀動脈綜合征和接受經皮冠狀動脈介入治療的患者發(fā)生血栓的風險明顯升高。ISR被認為與脂質代謝紊亂、血栓形成和炎癥反應等因素有關[1]。

本研究為進一步研究其機制，對2007—2010年在武警上?？傟犪t(yī)院心血管內科行冠狀動脈支架置入術后452例患者進行隨訪，經冠狀動脈造影或冠狀動脈CT檢查，選擇39例ISR患者入狹窄組，測定a-血小板膜糖蛋白-140(a-GMP-140)、血小板聚集率(PAR)、白細胞分化抗原40配體(CD40L)和基質金屬蛋白酶(MMP-s)等指標，旨在探討HPR在冠狀動脈支架置入術后ISR中的致病作用和相互關系，為減少支架置入術后ISR發(fā)生率提供依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 患者選擇和分組 根據冠狀動脈造影或冠狀動脈CT檢查，選擇冠狀動脈支架置入術后ISR患者39例為狹窄組，其中男性23例，女性16例;平均年齡66.7歲。狹窄組39例，按照ISR的程度進行分型和分組:Ⅰ型狹窄12例(Ⅰ型狹窄組)，Ⅱ型狹窄11例(Ⅱ型狹窄組)，Ⅲ型狹窄9例(Ⅲ型狹窄組)，Ⅳ型狹窄7例(Ⅳ型狹窄組);根據HPR進行分組:非血小板高反應性(NHPR)組27例，HPR組12例。選擇冠狀動脈造影或冠狀動脈CT檢查為血管正常者11例為對照組。對照組患者取血及檢查方法與狹窄組相同。

1.2 標本制備 患者分別于就診當天早晨抽空腹靜脈血5～6 ml，注入10 ml肝素抗凝至離心管，搖勻，3 500 r/min離心3 min，取上清，-70℃液化，冷凍待測 a-GMP-140、CD40L、MMP-2、MMP-9 等指標。

1.3 檢測指標 (1)CD40L測定:采用酶聯(lián)法(奧地利Bender Medsystems公司)。(2)MMP-2、MMP-9測定:采用酶聯(lián)法(北中山公司)。(3)a-GMP-140測定:取靜脈血4 ml緩慢注入2% 乙二胺四乙酸二鈉的抗凝試管中，混勻，然后取2 ml抗凝血與等量固定試劑混合，固定30 min，采用酶聯(lián)法測定(蘇州醫(yī)學院)。(4)PAR測定:取靜脈血3 ml，按9：1比例與3.8% 枸櫞酸鈉溶液混合抗凝，以二磷酸腺苷(ADP)10 ml為致聚劑，采用PAM-2型PPP自動平衡血小板聚集儀描記血小板聚集，根據描記計算PAR。

1.4 標準定義

1.4.1 HPR的定義設計 將血小板聚集率＞55%(預實驗測定的第75百分位數值)定義為HPR。

1.4.2 冠狀動脈支架置入術后ISR分型方法 心血管造影機多部位造影，造影機的圖像處理系統(tǒng)作狹窄定性或定量分析。根據所選血管最狹窄處進行評估:Ⅰ型:局灶型，病變長度＜10 mm;Ⅱ型:彌漫性支架內型，病變長度 ＞10 mm，限于支架內;Ⅲ型:彌漫增生型，病變長度＞10 mm，超出支架;Ⅳ型:完全閉塞型。若多個血管段置入支架引起多處狹窄，即以血管最狹窄處為主;管樣狹窄同樣以最狹窄處為主。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用均數±標準差(±s)表示。計量資料釆用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義;r＞0.5為存在相關性。

2 結果

2.1 血小板反應性指標與ISR狹窄程度關系 Ⅰ～Ⅳ型狹窄組 a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指標隨冠狀動脈狹窄程度的加重而增高，狹窄程度愈嚴重，a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指標增高越明顯，以Ⅲ型和Ⅳ型狹窄組最為明顯，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 血小板反應性指標與ISR狹窄程度的關系比較(±s)

表1 血小板反應性指標與ISR狹窄程度的關系比較(±s)

注:與對照組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01。

組別 例數(例)CD40L(ng/ml) MMP-2(ng/L) MMP-9(ng/L) a-GMP-140(μg/L) PAR(%)對照組 11 1.32 ±0.21 94.54 ±34.29 32.55 ±14.01 903.76±301.66 25.52 ±7.07Ⅰ型狹窄組 12 1.51 ±0.80 109.43 ±28.08 40.09 ±50.55a 969.90 ±380.84a 46.98 ±7.21bⅡ型狹窄組 11 1.60 ±0.91a 121.87 ±63.60a 53.57 ±38.79b 1 069.74 ±302.32a 52.02 ±9.03bⅢ型狹窄組 9 2.67 ±1.50b 140.51 ±71.02b 65.66 ±20.73b 1 250.10 ±343.87b 59.88 ±27.90bⅣ型狹窄組 7 2.78 ±1.61b 158.51 ±52.43b 67.79 ±17.60b 1 504.08 ±443.44b 61.90 ±17.97b

2.2 血小板反應性指標與HPR的關系 HPR組a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指標較 NHPR 組明顯升高，與NHPR組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

表2 血小板反應性指標與HPR的關系比較(±s)

表2 血小板反應性指標與HPR的關系比較(±s)

注:與 NHPR 組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01。

組別 例數(例) CD40L(ng/ml) MMP-2(ng/L) MMP-9(ng/L) a-GMP-140(μg/L) PAR(%)NHPR 組 27 2.06 ±0.41 117.39 ±24.65 45.63 ±20.72 1 191.04 ±39.15 43.51 ±5.59 HPR 組 12 2.62 ±0.94a 136.17 ±30.67a 51.70 ±11.12b 1 405.48 ±410.48b 58.42 ±10.11b

2.3 血清 CD40L、MMP-s與 a-GMP-140水平的相關性 CD40L與MMP-2(r=0.61)、CD40L與MMP-9(r=0.55)、CD40L 與 a-GMP-140(r=0.62)、MMP-2與a-GMP-140(r=0.51)呈相關性(r＞0.5);MMP-9與a-GMP-140無相關性(r＜0.5)。

3 討論

a-GMP-140是一種血小板膜蛋白，主要存在于血小板a-顆粒膜上，參與細胞連接和血栓形成，為具有特異性的血小板活化分子標志物[1]。HPR與急性冠狀動脈綜合征和接受經皮冠狀動脈介入治療的患者術后發(fā)生不良反應風險增加明顯有關。CD40L，即 CD154，是免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily，IgSF)成員，是一類膜蛋白，它能介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間的特異識別與結合，參與細胞內外的信號傳導，在血管炎癥反應、免疫調節(jié)、動脈粥樣硬化、血栓和斑塊形成等過程中發(fā)揮重要作用。MMP-s是一個內源性鋅依賴性蛋白酶家族，主要包括MMP-1、MMP-2、MMP-9等，在冠狀動脈斑塊破裂區(qū)域表達增強，通過降解細胞外基質而削弱纖維帽、促進斑塊破裂[2]。

本研究發(fā)現，Ⅰ～Ⅳ型狹窄組 a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指標隨冠狀動脈狹窄程度的加重而增高，HPR 組 a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指標明顯高于NHPR組，表明a-GMP-140、PAR、CD40L、MMP-s等指標更能反映出 HPR的特點且很大程度影響術后ISR的發(fā)生發(fā)展。在冠狀動脈ISR各個階段的病變過程中，最突出的特點是炎癥反應，主要表現為炎癥細胞活性增強、血漿中的炎性標志物CD40L等因子增高。其主要機制可能為:(1)CD40L等炎性介質是黏附分子的重要調節(jié)因子，Th1細胞表面CD40L與巨噬細胞表面CD40結合，向巨噬細胞提供敏感信號。這些胞外信號與細胞表面的受體結合后能激活細胞內的多條信號傳導通路[3]。在這些通路中，激活了的細胞內酪氨酸蛋白激酶和絲/蘇氨酸蛋白激酶能使黏附分子細胞內磷酸化，并影響其活化，使活化的黏附分子與配體結合的親合力增高。黏附分子與其配體結合后又能激活細胞內的其他多條信號傳導通路，實現巨噬細胞的進一步激活[4]。巨噬細胞激活后，釋放MMP-s。MMP-s通過降解血管壁上粥樣硬化斑塊纖維細胞外基質，削弱脂質斑塊纖維帽，使纖維帽變薄，減低粥樣沉積生長率和斑塊的穩(wěn)定性，進而斑塊破裂[5]，血小板激活，釋放大量 a-GMP-140，促進血栓形成。(2)雖然CD40L主要來自Th1細胞，但在ISR的病變發(fā)展過程中，來自血小板表面的CD40L分子的作用同樣不容忽視。因為循環(huán)中的血小板數目遠大于Th1細胞，且血小板具有向受損血管壁黏附聚集的特點。因此，當斑塊破裂之后，由活化血小板介導的炎癥反應對斑塊愈合過程具有非常不利的影響。分析其原因，破損斑塊除了外露膠原外，受損的內皮細胞、紅細胞、血小板等均可釋放出ADP，同時，在此浸潤的單核-巨噬細胞又能通過表達組織因子而使凝血酶產生增加，這些高濃度誘導劑的存在，使大量血小板在斑塊部位活化[6]，而活化血小板表面的CD40L又反過來與內皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞表面的CD40結合，加劇炎癥反應，釋放MMP-s增加，使斑塊更趨不穩(wěn)定或延遲其愈合，持續(xù)的斑塊不穩(wěn)定又會導致更多的血小板發(fā)生活化。這種炎癥反應與血小板活化相互介導、促進的機制，可能是部分ISR患者病情反復甚至惡化的因素之一[7]。(3)血小板CD40L等炎癥介質的激活和巨噬細胞等炎性細胞的浸潤可能導致內皮表面的黏附性增加和向內皮下跨膜轉移，組織因子濃度增加，增加置入支架血管內栓塞性閉塞和局部血管收縮的危險[8]。所以，CD40L等炎癥介質在冠心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此推測，HPR是術后ISR發(fā)生的重要影響因素之一，而HPR可能與 CD40L、MMP-s、a-GMP-140等分子引起的鏈鎖反應相關。

[1]戚德清，許康世.GPⅡb基因型急性心肌梗死患者介入治療前后GMP-140、vWF和 PAI-1水平[J].貴陽醫(yī)學院學報，2014，39(1):57-60.

[2]張慶成，趙杰，張向峰，等.急性冠脈綜合癥中40L和基質金屬蛋白酶致病作用的研究[J].中華實用診斷與治療雜志，2011，21(1):66-69.

[3]吳其夏，余應年，盧建，等.病理生理學[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2003:7.

[4]楊麗霞，田祥全，郭瑞威，等.冠心病患者外周血基質金屬蛋白酶誘導因子和尿激酶型纖溶酶原激活物水平與動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)特征的關系[J].中華心血管病雜志，2014，42(9):740-743.

[5]Campos TM，Passos ST，Novais FO，et al.Matrix metalloproteinase 9 production by monocytes is enhanced by TNF and participates in the pathology of human cutaneous Leishmaniasis[J].PLoS Negl Trop Dis，2014，8(11):e3282.

[6]Kandasamy AD，Chow AK，Ali MA，et al.Matrix metalloproteinase-2 and myocardial oxidative stress injury beyond the matrix[J].Cardiovase Res，2010，85(3):413-423.

[7]王阿蘭，丁效華，黃慧燕.阿托伐他汀對急性冠脈綜合征患者血清CD40L和MMP-9水平的影響[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2012，9(11):10-12.

[8]Suh SJ，Ko HK，Kim JR，et al.Ethylacetate fraction from Korean on MMP-9 activity and expression and on migration behavior of TNF-a induced human aortic smooth muscle cells[J].Toxicol In Vitro，2011，25(4):767-773.