張衛(wèi)霞 羅俊 潘年松

【摘要】目的 探討四種工藝從莪術(shù)中提取的揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞外LDH活性影響的差異性，并以此旁證遴選最優(yōu)工藝。方法 分別采用石油醚浸提法、超臨界CO2萃取法、壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制、水蒸氣蒸餾法提取莪術(shù)油，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)等純度鑒定后，分別配制成濃度為10、20、40、80、160、320、640μg/ml的莪術(shù)油干預(yù)Hela細(xì)胞72h，按照LDH試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平。結(jié)果 壓榨法提取的莪術(shù)油在20·g/ml、其它三種方式提取莪術(shù)油20·g/ml作用于Hela細(xì)胞72h后的LDH值與陰性組比較呈現(xiàn)出顯著差異性，且明顯呈量效正相關(guān)。結(jié)論 四種工藝提取的莪術(shù)油均可量效正相關(guān)地激活LDH；壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制莪術(shù)油對(duì)LDH的激活作用顯示出量效敏感優(yōu)勢(shì)，提示壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制可能為最佳工藝。

【關(guān)鍵詞】：莪術(shù)油；LDH；活性；比較

【中圖分類號(hào)】R722.12 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2015）03-0144-02

基金項(xiàng)目：貴州省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（黔科合SY（2008）3027號(hào)）。

溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具行氣破血，消積止痛之功。用于治療瘢瘕痞塊，淤血經(jīng)閉，食積脹痛，早期宮頸癌1。目前關(guān)于溫莪術(shù)中揮發(fā)油的提取工藝有水蒸氣蒸餾提取法、CO2超臨界萃取提取法、鮮品榨汁提取法、石油醚回流提取法2-4，但較少有文獻(xiàn)就揮發(fā)油的各種提取工藝的藥效學(xué)進(jìn)行比較，鑒于中藥的不同制備工藝所得的藥品抗腫瘤藥效也存在不同2。因此，對(duì)在不同工藝中提取的同一藥品進(jìn)行藥效比較從而篩選出最佳提取工藝是有必要的。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 溫莪術(shù)藥材購(gòu)于四川雙流縣溫郁金基地，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)副教授張學(xué)愈鑒定為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。四種莪術(shù)油（分別由水蒸氣蒸餾提取法、超臨界CO2萃取提取法、鮮品榨汁經(jīng)水蒸氣蒸餾精制法、石油醚浸提法提取，由遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校制備，用Tween-80溶解，配成10mg/mL的貯存溶液，4℃避光保存。

1.2試劑 人宮頸癌Hela細(xì)胞株（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，細(xì)胞編號(hào)：GDC009）；RPMI-1640培養(yǎng)基、MTT及胰酶（Sigma公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）。

1.3儀器 BIO-TEK ELX 800-UV全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特），LC-2900型高效液相色譜儀（上海天普）。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞的培養(yǎng) 取人宮頸癌Hela細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，每1-2天傳代一次。

1.4.2 MTT試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞消化并制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/ml，按每孔180·l接種于96孔板，培養(yǎng)24h后分為空白調(diào)零組（僅加培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照組（無血清培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu 10·g/ml）、溶酶組（加入等體積的0.5% Tween-80溶液）揮發(fā)油組（四種方式提取揮發(fā)油，均設(shè)10、20、40、80、160、320、640·g/ml七個(gè)濃度梯度組），每組設(shè)10個(gè)平行孔，每孔加入20ul的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)72h，于結(jié)束前4h小心吸去上清，加入無血清培養(yǎng)基200μl/孔，并加入20μl/孔濃度為5mg/ml的MTT，培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μl，混合器振蕩10min，使其充分溶解，置于自動(dòng)酶標(biāo)儀上，以490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度OD值[4]。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.4.3 LDH活性檢測(cè) 收集上述加無血清培養(yǎng)基之前的上清液，根據(jù)南京建成LDH試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平。LDH活性（U/L）=（測(cè)定孔OD值-對(duì)照孔OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值）×標(biāo)準(zhǔn)濃度（0.2mmol/L）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)×1000。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)以X±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有差異，P<0.01認(rèn)為有顯著性差異。

2.結(jié)果與討論

四種工藝提取莪術(shù)揮發(fā)油的LDH值較陰性對(duì)照組明顯升高（P<0.05，P<0.01），其中鮮品榨汁經(jīng)水蒸氣蒸餾精制法揮發(fā)油在320ug/ml時(shí)LDH值最高（表1）。

表1 四種方式提取莪術(shù)油作用于Hela細(xì)胞72h后的LDH值（U/L） （X±s，n=10）

藥物濃度（·g/ml） 莪（石） 莪（超） 莪（壓） 莪（水） 陰性對(duì)照組0 — — — — 97.39±12.3610 145.46±9.84 101.65±8.43 187.86±11.78﹡ 125.13±12.83 20 164.66±7.51﹡ 136.85±13.36﹡ 243.13±12.36△ 150.67±15.82﹡ 40 234.12±21.32△ 162.32±18.44﹡ 296.65±19.14△ 257.25±30.77△ 80 298.15±22.77△ 207.82±15.99△ 338.39±23.89△ 277.72±23.01△ 160 398.31±17.28△ 280.58±41.92△ 437.47±25.71△ 315.97±50.00△ 320 428.13±25.09△ 319.83±18.85△ 463.10±16.76△ 370.31±22.73△ 640 395.92±40.38△ 331.71±40.38△ 422.35±27.25△ 386.51±36.54△ 與陰性對(duì)照組比較﹡P<0.05，△P<0.01

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果總體趨勢(shì)而言，壓榨法提取的莪術(shù)油在20·g/ml、其它三種方式提取莪術(shù)油20·g/ml作用于Hela細(xì)胞72h后的LDH值與陰性組比較呈現(xiàn)出顯著差異性，且明顯呈量效正相關(guān)。

僅從壓榨粗油經(jīng)水蒸氣蒸餾法精制莪術(shù)油對(duì)激活LDH 活性較優(yōu)而論，從莪術(shù)中提取揮發(fā)油以先壓榨獲得粗油再水蒸氣蒸餾濃縮提取精油工藝為佳。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005

[2]鄒俊，涂銘旌，張學(xué)愈，等.不同提取工藝制備的溫莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制作用[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，39（4）：671～672.

[3]張學(xué)愈，盛勇，鄒俊，涂銘旌，潘年松，等.石油醚提取過50目和過325目篩目篩溫莪術(shù)揮發(fā)油收率比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：292～293.

[4]肖艷，李俊東，等.MTT法體外藥敏實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)宮頸癌細(xì)胞藥物敏感性的初步探討[J].癌癥，2007，26（4）：386-389.