張超 葛君 袁明婧 葉軍 袁立

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院　細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室，廈門　361102）

雞Vezf1基因RCAS干擾載體構(gòu)建及鑒定

張超 葛君 袁明婧 葉軍 袁立

（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室，廈門361102）

為研究Vezf1基因在雞胚早期發(fā)育過程中的作用，構(gòu)建了針對雞Vezf1基因的RCAS病毒RNA干擾載體，分別在雞胚細(xì)胞和胚胎水平對Vezf1基因?qū)嵤┏聊ㄟ^Real-time PCR和原位雜交法檢測目的基因mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，基于RCAS病毒的干擾載體可以在雞胚成纖維細(xì)胞和活體雞胚中成功沉默Vezf1基因的表達(dá)。此研究為利用雞胚模型深入了解Vezf1基因在早期發(fā)育過程中的作用提供了素材。

RCAS載體；RNAi；Vezf1；雞胚

Vezf1（Vascular endothelial zinc finger 1）是最先在小鼠卵黃囊血島中發(fā)現(xiàn)的一個血管內(nèi)皮及其前體細(xì)胞特異表達(dá)的基因。Vezf1基因編碼一個56 kD大小的蛋白質(zhì)，由518個氨基酸組成，包含6個C2H2型（kruppel樣）的鋅指結(jié)構(gòu)基序和C端富含脯氨酸的反式轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域［1］。鋅指蛋白基因家族是最重要的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，該家族的基因產(chǎn)物廣泛參與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育，并與許多疾病的發(fā)生相關(guān)。C2H2型鋅指是鋅指蛋白家族中最普遍的類型，它們作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與許多生理過程［2］。Vezf1最初可以在發(fā)育至7.25 d的小鼠胚胎中胚層前部檢測到，只限定在血管內(nèi)皮及其前體細(xì)胞上表達(dá)，伴隨胚胎發(fā)育初期的血管發(fā)生（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）過程。因此，它可能是控制著某些內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、心血管系統(tǒng)的發(fā)育和血管新生等重要生理過程［3］。

雞胚是發(fā)育生物學(xué)重要的模式動物之一，幾個世紀(jì)以來被廣泛應(yīng)用于發(fā)育、免疫、病毒及細(xì)胞生物學(xué)研究中［4］。與其他動物模型相比，它具有許多與生俱來的優(yōu)勢。首先，雞胚可以非常方便地獲得，并可以在其發(fā)育的任何階段進(jìn)行體外操作和直接觀察，為研究提供了極大的便利；同時鳥類與哺乳動物進(jìn)化距離相近，因而也是基因功能研究的理想體內(nèi)模型［5］。雞胚有多種體外培養(yǎng)體系，可以在無殼的體外環(huán)境下培養(yǎng)，進(jìn)一步提高了它的可操作性［6］。另外，還可以利用雞-鵪鶉嵌合體模型進(jìn)行研究，在早期血管發(fā)育研究中具有得天獨厚的優(yōu)勢［7］。通過雞胚這一重要的模式生物，人們在發(fā)育生物學(xué)方面已經(jīng)取得了許多重要發(fā)現(xiàn)。例如，B淋巴細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、成熟和分化機(jī)制［8］，病毒的致瘤性［9］，神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化等［10］。研究雞胚中Vezf1基因的功能對于深化Vezf1基因在血管系統(tǒng)發(fā)育中功能的認(rèn)識，以及在小鼠以外的其他模式動物中的功能與作用機(jī)制，具有重要的意義。

RNAi技術(shù)是目前在雞胚中進(jìn)行基因功能研究的重要手段之一。RCAS［Replication-Competent ASLV long terminal repeat（LTR）with a Splice acceptor］是目前在雞胚中較為常用的基因沉默載體。它來源于禽類勞氏肉瘤病毒，是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一種［11］。復(fù)制完全型的RCAS載體病毒可以在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制而無需其他的輔助質(zhì)粒，將RCAS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雞成纖維細(xì)胞或DF1細(xì)胞，大量病毒顆粒包裝后釋放到培養(yǎng)液中，收集并濃縮后即可用于感染細(xì)胞和活體胚胎。由于可以在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并釋放出大量病毒感染臨近的處于分裂期的細(xì)胞，因此RCAS病毒與慢病毒載體相比特別適合于感染胚胎早期處于快速分裂期的細(xì)胞并造成胚胎大面積的感染，這更有利于在活體胚胎上的基因沉默實驗［12］。

本研究首次構(gòu)建雞胚Vezf1基因RCAS病毒干擾載體，并在活體雞胚體內(nèi)對Vezf1基因?qū)嵤┏聊瑱z測基因沉默的效果，旨為在雞胚中深入研究vezf1基因的功能和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚與細(xì)胞株 所使用的SPF級種蛋購自濟(jì)南斯帕法斯有限公司，DF1細(xì)胞系及原代雞胚成纖維細(xì)胞為本室保存。

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和實驗試劑 E.coli DH5α菌株為本室保存，RCAS、pRFPRNAi質(zhì)粒為英國羅斯林研究所MJ.McGrew博士惠贈，引物合成（廣州英駿生物技術(shù)有限公司），限制性內(nèi)切酶和TurboFect轉(zhuǎn)染試劑（Fermentas公司），T4 DNA連接酶（TaKaRa公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ReverTra Ace qPCR RT Kit和SYBR Green（TOYOBO公司），Trizol（Invitrogen公司），DIG探針制備試劑盒（SP6/T7）（Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 RCAS干擾載體的構(gòu)建 使用GenScript siRNA Target Finder siRNA靶位點設(shè)計軟件進(jìn)行RNAi靶點篩選和引物設(shè)計。通過PCR的方法合成帶有插入位點和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RCAS干擾質(zhì)粒DNA插入片段，PCR反應(yīng)程序為：95℃ 2 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃ 保持。然后將目的片段膠回收，分別用Nhe I和Afl II兩種核酸內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增片段和pRFPRNAi質(zhì)粒酶切后使用T4 DNA連接酶連接。經(jīng)鑒定無誤后再使用Not I和Cla I核酸內(nèi)切酶將連接有插入序列的pRFPRNAi載體的基因沉默元件切下，連接到RCAS載體上［13］。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從轉(zhuǎn)化的平板上挑取DNA單克隆菌落，使用Not I和Cla I核酸內(nèi)切酶雙酶切驗證質(zhì)粒，并測序插入片段，確保獲得正確克隆。根據(jù)miRNA30型發(fā)夾結(jié)構(gòu)設(shè)計引物（表1）。其中正義鏈靶位點5'端一個堿基設(shè)計成錯配以模擬miRNA30的結(jié)構(gòu)。

表1 Vezf1基因沉默載體引物序列

1.2.2 RCAS病毒的包裝、濃縮和滴度測定 將DF1細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞密度達(dá)到約80%左右時根據(jù)TurboFect轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染。72 h后觀察綠色熒光陽性細(xì)胞達(dá)到總細(xì)胞數(shù)的90%以上時，收集病毒上清，并重新加入含有2% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，之后每24 h收集病毒1次，共收集3次。病毒上清使用0.45 μm濾器過濾后置于Beckman高速離心機(jī)，4℃，50 000×g，離心2.5 h。取出離心管，小心地倒掉上層液體，此時可見病毒聚集于管底呈白色，加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，冰上輕搖1-2 h，待完全溶解后分裝于-80℃凍存。取部分病毒使用梯度稀釋法進(jìn)行病毒滴度檢測。

1.2.3 活體雞胚病毒顯微注射實驗 SPF雞種蛋的保存和使用參考Chapman等［14］的方法稍加改進(jìn)。將種蛋取出用75%酒精擦拭表面，用眼科剪在種蛋底部的位置打一個剛能插入針頭的小孔，用5 mL注射器緩慢抽除1-1.5 mL蛋清，小心避免卵黃囊破損。鈍端朝上靜置3-5 min。同時從-80℃冰箱中取出病毒，冰上解凍，加入1/10體積的亮綠；用眼科剪先在雞蛋氣室端上部打一個洞，再小心地剪開蛋殼，使胚胎剛好曝露在剪開的圓形窗口中，將雞蛋置于體視顯微鏡下，用準(zhǔn)備好的注射用毛細(xì)管吸取定量的病毒液，小心地注射到雞胚的相應(yīng)部位；用透明膠帶將開口封嚴(yán)，避免膠帶接觸蛋清，放入孵化箱繼續(xù)孵化；孵化至預(yù)定時間后，將雞蛋取出，去除封口膠帶，置于體視熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況或?qū)㈦u胚小心的用眼科剪剪下置于倒置熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.4 細(xì)胞和胚胎RNA提取及qPCR檢測實驗 將本實驗室保存的SPF 8日齡雞胚成纖維細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過夜貼壁后加入5 mL病毒上清液感染12 h，然后換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染3 d后，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入6 mL PBS清洗并重復(fù)一次，將PBS清洗液棄去后加入1 mL Trizol，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min；對于胚胎應(yīng)先使用眼科剪將胚胎剪碎。RNA提取步驟按照Trizol說明書進(jìn)行。然后使用ReverTra Ace qPCR RT Kit對上述提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

qPCR引物及內(nèi)參基因GAPDH引物設(shè)計如下：qPCR的反應(yīng)程序如下：95℃ 3 min；95℃ 10 s，62℃45 s，40個循環(huán)；熔解曲線 55-95℃；結(jié)束反應(yīng)。

1.2.5 雞胚原位雜交實驗 將胚胎在4%新鮮（或新解凍的）的多聚甲醛（PAF）中固定（使用PBS配制），4℃過夜；在PBT（PBS+ 0.1%Tween20）中分離胚胎，置于脫色搖床上輕搖5 min洗1次；胚胎經(jīng)過一系列梯度的甲醇/PBT脫水，分別是25%、50%、75%和100%，在每個梯度下胚胎室溫輕搖5 min，再用100%的甲醇洗5 min。此后胚胎可以在-20℃保存1個月。

首先用羅氏DIG探針制備試劑盒合成探針，具體方法見使用說明。胚胎原位雜交步驟如下：將胚胎梯度復(fù)水后用6%過氧化氫漂白1 h；蛋白酶K處理15 min；2 mg/mL甘氨酸洗10 min后用4% PFA和0.2%戊二醛室溫處理20 min；加入RNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)70℃過夜。第2天使用10%熱滅活山羊血清封閉后加入抗體4℃過夜。第3天使用TBST清洗胚胎，于4℃輕搖過夜。第4天加入NBT/BCIP反應(yīng)混合液顯色，之后用4% PFA/0.1%戊二醛后固定。

2 結(jié)果

2.1 雞Vezf1基因RCAS沉默載體的構(gòu)建

使用OligoW和OligoY引物與Vezf1451-F和Vezf1451-R引物PCR合成帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA插入片段長度為170 bp，PCR產(chǎn)物兩端分別帶有Nhe I和Afl II酶切位點。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后，使用內(nèi)切酶Nhe I和Afl II分別酶切PCR產(chǎn)物和pRFPRNAi質(zhì)粒，然后用T4 DNA連接酶連接并鑒定（圖1-A）。取連接成功的質(zhì)粒用內(nèi)切酶Not I和Cla I酶切，并將切下的較短片段用膠回收試劑盒回收，RCAS質(zhì)粒也使用Not I和Cla I酶切后與上一步的酶切片段連接（圖1-B）。最后使用同樣的內(nèi)切酶驗證載體構(gòu)建成功，目的片段約900 bp（圖1-C），經(jīng)測序顯示RCAS-1451與設(shè)計序列相同無突變。

2.2 RCAS病毒的包裝和細(xì)胞水平Vezf1基因沉默效果檢測

分別將RCAS質(zhì)粒和RCAS-1451質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞，包裝的病毒具有自我復(fù)制能力可以在培養(yǎng)皿內(nèi)形成反復(fù)感染，3 d后收集含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用含有RCAS和RCAS-1451病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液感染從八日齡SPF雞胚中原代分離的成纖維細(xì)胞。RCAS載體病毒自身表達(dá)GFP蛋白作為指示標(biāo)記物，可以通過觀測熒光表達(dá)分析病毒感染情況。使用病毒感染3 d后，細(xì)胞的感染率可以達(dá)到95%以上（圖2）。

圖1 RCAS-1451病毒載體構(gòu)建及驗證

圖2 RCAS病毒感染SPF八日齡雞胚成纖維細(xì)胞

提取被病毒感染的雞成纖維細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用qPCR法檢測病毒對Vezf1基因的沉默效率。首先用標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測了Vezf1和內(nèi)參基因GAPDH基因qPCR引物的擴(kuò)增效率，兩者分別為99%和98%，符合采用2-△△Ct算法對qPCR檢測引物擴(kuò)增效率在95%-105%之間的要求。經(jīng)qPCR檢測RCAS-1451病毒干擾組的Vezf1基因相對表達(dá)量為正常對照組的28%（圖3）。

圖3 qPCR檢測病毒在細(xì)胞和胚胎水平上對Vezf1基因的沉默效率（n=5，*P＜0.05）

2.3 RCAS病毒對活體雞胚感染及胚胎水平Vezf1基因沉默效果檢測

為檢測活體胚胎注射病毒的感染效果，在HH stage 1（孵化前期）雞胚的胚胎下腔中注射1.5-2 μL病毒后于第3-4天在熒光體視顯微鏡下觀察胚胎的感染情況。結(jié)果（圖4）顯示，胚胎的頭部、軀干部及腦泡等各部位均觀察到明顯的GFP表達(dá)，表明胚胎已成功被RCAS載體病毒感染。

分別將RCAS-1451干擾病毒和RCAS對照病毒注射的胚胎取出并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR檢測干擾組病毒在活體胚胎水平上對Vezf1基因的沉默效果。對qPCR結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計，注射干擾組RCAS-1451病毒的胚胎與對照組相比Vezf1的表達(dá)水平平均降低了52%，比在細(xì)胞水平上檢測的72%的抑制效率相比有所降低。

圖4 體視顯微鏡下觀察胚胎感染效果

為了更直觀地檢驗RCAS-1451病毒在活體雞胚上對Vezf1基因的沉默效果，進(jìn)一步使用原位雜交的方法進(jìn)行了干擾病毒感染后基因表達(dá)情況的檢測。首先，合成了針對Vezf1基因的反義鏈RNA探針，并另外合成正義鏈RNA探針作為陰性對照。分別用RCAS-1451病毒和RCAS對照組病毒感染胚胎，3 d后將胚胎取出，進(jìn)行原位雜交實驗，原位雜交顯色的深淺可以顯示基因在胚胎上的表達(dá)情況。結(jié)果（圖5）顯示，使用RCAS-1451病毒感染的胚胎與RCAS感染的對照組胚胎相比，在Vezf1基因表達(dá)比較豐富的腦泡、眼部、前吻、肢芽等處Vezf1的表達(dá)都明顯降低，而使用正義鏈探針的陰性對照組胚胎沒有顯色。以上結(jié)果表明，我們構(gòu)建的RCAS干擾載體病毒在活體胚胎水平上有效沉默了Vezf1基因的表達(dá)。

圖5 原位雜交法檢測RCAS-1451病毒在活體雞胚上對Vezf1基因的抑制情況

3 討論

近年來，基因敲除技術(shù)逐漸成為研究基因功能必不可少的工具，但傳統(tǒng)的基因敲除手段很難用于雞胚而獲得基因敲除或功能缺失的個體，利用RNAi進(jìn)行基因沉默表達(dá)是理想的研究方法。目前在雞胚導(dǎo)入基因干擾載體主要通過電穿孔法和病毒感染法。電穿孔轉(zhuǎn)入技術(shù)可以快速在雞胚導(dǎo)入基因表達(dá)構(gòu)件［15，16］。但該方法有許多缺點：首先，質(zhì)粒的表達(dá)是瞬時的，一般電轉(zhuǎn)后表達(dá)只能持續(xù)1 d左右然后就逐漸減弱［17］；第二，作用范圍局限，主要用于對具有管腔結(jié)構(gòu)的組織感染［18］；第三，電穿孔法易對胚胎造成損傷。利用病毒自然感染的特性導(dǎo)入基因干擾構(gòu)件則可以克服電擊導(dǎo)入法的許多不足。RCAS載體系統(tǒng)來源于雞勞氏肉瘤病毒（RSV），對雞胚和細(xì)胞具有較強的感染能力［19］。另外，與哺乳動物中常用的慢病毒載體系統(tǒng)相比RCAS病毒可以自我包裝復(fù)制而無需其他輔助質(zhì)粒，有利于病毒的包裝和胚胎的大面積感染。目前，這方面的實驗性的研究還甚為缺乏，偶見一些利用病毒感染實施雞胚基因沉默的報道，但基本上都是針對特定部位進(jìn)行感染［20，21］。本研究首次使用RCAS載體病毒在活體胚胎水平對Vezf1基因?qū)嵤┏聊?，并分別用qPCR和原位雜交法檢測基因沉默效果，成功實施了基因沉默。

qPCR基因沉默效率檢測結(jié)果顯示，RCAS病毒在胚胎水平的基因沉默效率比細(xì)胞水平有所降低，其原因可能是病毒在胚胎體內(nèi)水平上的感染很難達(dá)到像體外細(xì)胞感染一樣的細(xì)胞感染效率。另外，活體水平上的基因調(diào)控機(jī)制也遠(yuǎn)比細(xì)胞水平上的復(fù)雜，可能Vezf1基因沉默后的其他代償調(diào)劑機(jī)制抵消了一部分基因抑制效果。我們的檢測結(jié)果顯示，RCAS病毒在活體胚胎水平上依然可以對靶基因形成50%以上的基因沉默。本研究為RCAS載體病毒胚胎水平基因沉默技術(shù)提供了新的參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了雞Vezf1基因的RCAS載體病毒，該RCAS載體病毒能夠成功在細(xì)胞和胚胎水平上對Vezf1實施基因沉默表達(dá)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Identification and Construction of RCAS RNA Interference Vector for Chicken Vezf1

Zhang Chao Ge Jun Yuan Mingjing Ye Jun Yuan Li
（School of Life Sciences，State Key Laboratory of Cellular Stress Biology，Xiamen University，Xiamen361102）

In order to study the role of Vezf1 during the earlier development of chicken embryo， RNA interference vector for the chicken Vezf1 was constructed based on RCAS viral vector system， and the gene silencing of chicken Vezf1 was carried out in both embryonic cells and chicken embryos， and the mRNA expression was measured by Real-time PCR and in situ hybridization. Results showed that this interference vector from RCAS virus could keep Vezf1 expression silencing successfully in chicken embryo fibroblasts and chick embryos. This study provides a fundamental data for studying the Vezf1’s role during early embryonic development using the chicken model.

RCAS vector；RNAi；Vezf1；chicken embryo

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.015

2014-11-25

國家自然科學(xué)基金項目（30671021），福建省自然科學(xué)基金項目（2007J0113）

張超，男，博士研究生，研究方向：血管分子發(fā)育生物學(xué)；E-mail：zhangchao_xmu@aliyun.com

袁立，男，教授，研究方向：血管分子發(fā)育生物學(xué)；E-mail：yuanli@xmu.edu.cn