向 攀

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州　730000）

捕食線蟲性真菌培養(yǎng)基篩選及優(yōu)化

向 攀

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730000）

為了弄清少孢節(jié)叢孢菌（Arthrobotrys oligospora）的最佳條件生長條件，文章對從實驗室中篩選出的一株具有高捕食能力的菌307進(jìn)行了培養(yǎng)基、溫度、pH三方面研究。結(jié)果表明該菌最優(yōu)化的培養(yǎng)基為：06WSA，培養(yǎng)條件pH=7.0，溫度25℃。

捕食線蟲性真菌生物防治培養(yǎng)基pH值溫度

寄生蟲對家畜的危害十分嚴(yán)重，急需采取一種安全生態(tài)的防治方式。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)殺線蟲性真菌（nematode-destroying fungi）200多種。近幾年來，我國在這一領(lǐng)域的研究也取得了大量成果，如楊曉野等人成功地分離鑒定了少孢節(jié)叢孢菌并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了深入研究，另外蔡葵蒸教授對其捕食情況及工藝培養(yǎng)也做了較全面研究。研究捕食線蟲真菌最佳培養(yǎng)條件，是開展用捕食線蟲性真菌防治寄生性線蟲的重要前提。本研究擬對捕食線蟲性真菌A.oligospora的培養(yǎng)基、pH值和溫度對其生長的影響做報道，為今后利用捕食性真菌開展動物線蟲病的生物防治研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

菌種：從實驗室中篩選出的一株具有高捕食能力的少孢節(jié)叢孢菌，命名為307。

主要實驗用品：實驗藥品：玉米，麩皮，瓊脂，蛋白胨，蒸餾水，1mol/L的NaOH和HCl溶液。

儀器及玻璃器皿：天平、移液管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗、手術(shù)刀、酒精燈、電熱鼓風(fēng)干燥箱、酸度計、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基組分及濃度的影響

稱取新鮮過篩的玉米粉（麩皮粉）320 g，加蒸餾水1 000 ml，微火煮沸1 h 后，補足蒸餾水至1 000 ml，混勻，用多層紗布過濾。取濾液10 ml，加蒸餾水990 ml，沉淀24h；再配成濃度為0.4 g/L玉米，0.4 g/L麩皮，0.6 g/L玉米，0.6 g/L麩皮及玉米和麩皮按照1：1、1：2、1：3、1：4、1：5的組分配制。

（注：實驗組其他同學(xué)研究得出在0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L中 0.4 g/L和 0.6 g/L 生長較好，是在此基礎(chǔ)之上設(shè)定的培養(yǎng)基條件。）

1.2.2不同初始pH值對菌絲生長率的影響

在第1組所選出的最有培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同初始pH：pH值定為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0共11個梯度。

1.2.3不同溫度對少孢節(jié)叢孢菌菌絲生長率的影響

在第2組的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同培養(yǎng)溫度：培養(yǎng)溫度分別為15℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃共4個梯度。

2　真菌培養(yǎng)

上述各種培養(yǎng)基配制后于121 ℃全自動高壓滅菌20 min，倒平皿，將培養(yǎng)基倒置。每類型設(shè)置3個平行，標(biāo)記好各平皿。實驗重復(fù)1次。將菌絲連同瓊脂按比例尺切成5 mm ×5 mm的小塊，接入制備好的固體培養(yǎng)基中。每日定時觀察菌生長情況，測量其生長率，用mm/d單位表示。每個組接種3個培養(yǎng)皿，試驗重復(fù)1次，直至長滿平皿。

3　結(jié)果與分析

3.1不同基質(zhì)對菌絲生長率的影響

由圖1可見：混合培養(yǎng)基和單一培養(yǎng)基促生長速度0.6 g/L ＞ 0.4 g/L；同濃度下促生長速度WSA＞CMA效果相對理想。試驗創(chuàng)新性的使用麩皮培養(yǎng)基的優(yōu)勢是成立的。

3.2不同pH對真菌生長率的影響

由圖2，菌絲生長適宜的初始pH值范圍是6.5～8.0，在該范圍內(nèi)，菌絲產(chǎn)量都較高；其中pH值為7.5時生長率達(dá)到5.5 mm/d；pH=7.0時為5.4 mm/d次之；pH值小于5.5或大于8.0時，菌絲生長率急速下降。

3.3不同溫度對菌絲生長率的影響

由圖3可知：不同溫度情況下菌絲生長速率不同，25 ℃最好，其次是20 ℃，大于或小于這個溫度，菌絲生長速率相對較緩。

4　培養(yǎng)基正交試驗優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實驗設(shè)計，選取不同培養(yǎng)基基質(zhì)（CMA：WSA）（0.41：4、0.61：5、06WSA）、溫度（20℃、25℃、30℃）、pH（7、7.5、8）3個因素進(jìn)行，L9（34）正交試驗以優(yōu)化培養(yǎng)基組成，正交結(jié)果見表1。

由正交試驗結(jié)果方差分析表可知：最佳組合為A3B2C1，即優(yōu)化培養(yǎng)基為：o6WSA，pH=7.0，培養(yǎng)溫度=25 ℃。從結(jié)果極差得出影響307的因素大小為：RC＞RB＞RA，即pH＞溫度＞培養(yǎng)基質(zhì)。

5　加幼蟲液觀察菌的捕食情況表

做培養(yǎng)基06WSA，初始pH=7.0，06WSA瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌絲連同瓊脂按比例尺切成5 mm ×5 mm的小塊，接入制備好固體培養(yǎng)基中，待菌絲長至1/3平皿，加入幼蟲液。菌絲生長密集（圖4），培養(yǎng)基表層長出氣生菌絲（圖5）、分生孢子結(jié)構(gòu)（圖6）。

圖1　不同基質(zhì)菌絲生長速率（mm/d）

圖2　不同pH真菌菌絲直徑（mm/d）

圖3　不同T對菌絲生長率的影響

圖4　06WSA培養(yǎng)基深層菌絲 -40×

圖5　氣生菌絲 -40×

圖6　分生孢子-100×

線蟲幼蟲可以刺激捕食線蟲性真菌產(chǎn)生捕食性結(jié)構(gòu)（圖7）。線蟲幼蟲一旦接觸到它們，就會被套住而遭捕獲（圖8），經(jīng)1～2 h 后死亡。

圖7　菌環(huán)將線蟲捕食 -200×

圖8　菌網(wǎng)將幼蟲捕食 -200×

在擬定的試驗條件下，捕食線蟲性真菌長勢較好，形成氣生菌絲（圖10），分生孢子（圖11）。

6　討論

（1）本試驗對捕食線蟲性真菌最適培養(yǎng)基組成進(jìn)行了優(yōu)化，研究結(jié)果顯示：菌在06 麩皮粉固體培養(yǎng)基生長較好。這是實驗的一大創(chuàng)新之處。在正交試驗時得出最適pH值為7.0，但最佳pH值范圍6.5～8.0與已報道的研究結(jié)果有一定出入。內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)楊曉野等人曾系統(tǒng)的研究過少孢節(jié)叢孢菌的生長特性，其生長所需最佳pH值為6.0～6.2。分析其原因可能是由于菌株來源不同或經(jīng)過幾代過程已發(fā)生變異的結(jié)果，這有待于進(jìn)一步研究驗證。

（2）首次試用麩皮培養(yǎng)基進(jìn)行實驗。做成麩皮瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)捕食線蟲性真菌有其獨特優(yōu)勢，較馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）具有更高的透明度，易于觀察；較之玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA），真菌生長速度快，縮短菌株培養(yǎng)時間，且也容易形成孢子。

7　結(jié)論

成功優(yōu)化篩選出培養(yǎng)基06WSA，初始pH=7.0，培養(yǎng)溫度25℃。該培養(yǎng)基不僅利于菌絲生長，且對氣生菌絲的生長，分生孢子的形成，捕食結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)都有著優(yōu)越之處。今后若培養(yǎng)少孢節(jié)叢孢菌，建議使用該培養(yǎng)基，希望能夠為后續(xù)研究與實踐工作的開展提供一定的參考與借鑒。

［1］ 王軍.防制家畜寄生性線蟲病的新措施［J］.當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2010，（1）：21-22.

［2］ 楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮，等.捕食線蟲性真菌的分離培養(yǎng)及分布規(guī)律［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2003，（4）：344-347.

［3］ 王瑞，楊曉野，楊蓮茹，等.不同碳氮源及其比例和培養(yǎng)基初始pH值不同碳氮源及其比例和培養(yǎng)基初始pH值對少孢節(jié)叢孢菌菌絲生長影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008，（9）：11-14.