彭呂嬌 康曉靜 伊力努爾·哈力甫 柴莉 李娜

活性誘導性胞嘧啶脫氨基酶表達與黑素瘤侵襲轉移、預后的相關性分析

彭呂嬌 康曉靜 伊力努爾·哈力甫 柴莉 李娜

目的 探討活性誘導性胞嘧啶脫氨基酶（AID）與黑素瘤侵襲轉移、預后的關系和臨床意義。方法 免疫組化SP法檢測AID蛋白在80例黑素瘤、23例色素痣石蠟包埋組織切片中的表達，結合臨床病理生物特性進行分析。結果 黑素瘤AID蛋白的陽性表達率53.75%（43/80），色素痣的表達率13.04%（3/23），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AID蛋白的表達與黑素瘤淋巴結轉移、Clark分級、浸潤深度及預后密切相關（P＜0.05），在年齡、性別、民族之間差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。19例發(fā)生BRAF突變黑素瘤組織中，AID蛋白17例陽性表達，其中15例BRAFV600E突變的黑素瘤AID蛋白均陽性表達。結論 AID蛋白可能誘導了黑素瘤BRAF突變，并參與黑素瘤的侵襲、轉移，與預后相關。

黑色素瘤；預后；腫瘤轉移；突變；活性誘導性胞嘧啶脫氨基酶

活性誘導性胞嘧啶脫氨基酶（activation-induced cytidine deaminase，AID），是一種可以改變基因序列的基因編輯酶，其異常表達可引起非Ig基因的核苷酸序列改變，導致多種腫瘤的生成，并參與腫瘤的侵襲和轉移［1-3］。位于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑的BRAF基因是黑素瘤中突變率最高的基因，也是黑素瘤特異性靶向治療研究熱點基因［4］。本課題組前期研究顯示新疆地區(qū)黑素瘤中存在BRAF基因突變，并以V600E突變?yōu)橹鳎?］。我們用免疫組化方法檢測80例黑素瘤組織中AID蛋白的表達，結合前期BRAF突變檢測分析，探討AID蛋白表達與BRAF突變、黑素瘤臨床病理特征的關系。

一、資料與方法

1.標本來源及特征：選取新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科及皮膚科2004年1月至2013年12月明確診斷為黑素瘤的石蠟包埋組織80例及色素痣組織標本23例。所有標本均經HE染色及病理診斷證實。80例黑素瘤患者均未做化療、放療及抗免疫治療，并已經前期［5］BRAF突變DNA檢測。80例黑素瘤患者中維吾爾族39例，漢族41例；男42例，女38例；年齡22～94歲，平均57.5歲；浸潤深度：組織學表現(xiàn)為原位黑素瘤（腫瘤細胞未突破基底膜）26例，侵襲性黑素瘤（腫瘤細胞突破基底膜向真皮內侵襲）54例；組織學Clark分級：Ⅰ～Ⅲ級27例，Ⅳ～Ⅴ級53例；伴隨淋巴結轉移32例，無淋巴結轉移48例；臨床預后：預后不良（3年內隨訪出現(xiàn)多器官轉移或死亡）39例，預后良好24例，失訪17例。

2.主要試劑：一抗是小鼠抗人AID IgG單克隆抗體（美國Invitrogen公司），鼠兔通用型二抗、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

3.免疫組化SP法檢測AID蛋白表達：將4%甲醛固定、石蠟包埋的黑素瘤組織制成3 μm切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化；浸入0.01 mmol/L pH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內，熱抗原修復3 min；3%H2O2室溫孵育30 min;DAB顯色1 min左右；自來水沖洗，蘇木精復染，通透、脫水，中性樹膠封片，高分辨顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。

4．結果判斷：AID蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細胞質。觀察全片，借助高分辨顯微鏡隨機取不重疊的5個×200視野，得出陽性細胞所占百分比。采用半定量積分法，對每張切片的陽性細胞率及陽性細胞著色強度進行分級計分。染色強度分為3級：無著色0分，淺著色1分，棕黃色2分；按陽性細胞的百分比分4級：＜5%0分，5%～25%1分，26%～50%2分，51%～75%3分，＞75%4分。每張切片最后的得分為兩次評分的乘積：≥3分是陽性，＜3分是陰性。

5.統(tǒng)計學方法：采用SPSSl8.0統(tǒng)計軟件，AID蛋白在黑素瘤和色素痣組織中表達率、黑素瘤患者中AID蛋白質表達情況與患者臨床病理特征的關系比較均采用χ2檢驗。

二、結果

1.AID蛋白在黑素瘤和色素痣組織中的表達：80例黑素瘤石蠟包埋組織中，AID蛋白陽性表達43例，為細胞質棕黃色著色，表達率為53.75%（43/80）。23例色素痣組織中檢測到3例AID陽性表達，AID陽性表達率為13.04%（3/23），兩組陽性表達率間差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝11.977，P＝0.001）。

2.AID蛋白表達與臨床病理特征的關系：AID陽性表達的黑素瘤組織多伴隨淋巴結轉移，且AID陽性表達率隨黑素瘤組織Clark分級升高及浸潤深度加深而增高（P＜0.05）。AID蛋白的表達在不同年齡、性別、民族之間分布，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 黑素瘤患者臨床特征與AID蛋白質表達關系［例（%）］

在80例AID陽性表達黑素瘤患者中隨訪到63例患者。其中，32例AID陽性表達黑素瘤患者，在3年隨訪期間有15例出現(xiàn)了多器官轉移，9例死亡，預后不良的患者占總數的75%（24/32）；而在31例AID陰性表達黑素瘤患者中預后不良的患者僅占總隨訪數的48%（15/31）。與AID陰性表達的黑素瘤患者相比，AID陽性的患者更易出現(xiàn)預后不良（P＜0.05）。

3.AID蛋白陽性表達與BRAF突變關系：將免疫組化結果與前期BRAF突變DNA檢測結果［5］對比后發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生BRAF突變的19例黑素瘤患者中，15例V600E突變，1例L597Q突變，1例G593C突變黑素瘤組織AID蛋白均為陽性表達；1例S465F突變與1例P453H突變黑素瘤組織中AID蛋白陰性表達。發(fā)生BRAF突變的19例黑素瘤組織中AID蛋白陽性表達率為89.5%（17/19）。發(fā)生BRAFV600E突變的15例黑素瘤組織中AID蛋白陽性表達率為100%（15/15）。

三、討論

AID是胞嘧啶脫氨基酶家族成員之一，參與編碼DNA和RNA，是免疫球蛋白基因組發(fā)生2次突變必須的酶。隨后，Okura等［6］對黑素瘤患者隨訪發(fā)現(xiàn)，AID蛋白陽性表達的黑素瘤患者多表現(xiàn)為臨床預后不良，10例中有8例在4年內出現(xiàn)多器官轉移和/或多個淋巴結轉移灶，而AID陰性表達的黑素瘤患者預后較好。本研究在43例AID陽性表達黑素瘤患者中隨訪到32例患者，在3年隨訪期間有15例出現(xiàn)了多器官轉移，9例死亡，75%（24/32）患者預后不良，而AID陰性表達黑素瘤患者中48%（15/31）預后不良，可見AID的表達與黑素瘤預后有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，Clark分級、淋巴結轉移、浸潤深度與AID的表達有關。AID陽性表達的黑素瘤患者多伴隨淋巴結轉移，且黑素瘤AID陽性表達率隨Clark分級升高及浸潤深度加深而增高。本研究用免疫組化法分析了AID蛋白在黑素瘤中的表達情況，發(fā)現(xiàn)AID陽性的黑素瘤患者較AID陰性表達的患者更易出現(xiàn)預后不良（P＜0.05）。AID蛋白有望成為一個重要的黑素瘤預后預測指標，對黑素瘤的預后評估有重要意義。免疫組化檢測黑素瘤中的AID蛋白表達具有快速、直觀、價格相對低廉等優(yōu)點，能為黑素瘤患者制定個性化治療方案提供幫助。

［1］Yoshikawa K,Okazaki IM,Eto T,et al.AID enzyme-induced hypermutation in an actively transcribed gene in fibroblasts［J］. Science,2002,296（5575）:2033-2036.

［2］Wedekind JE,Dance GS,Sowden MP,et al.Messenger RNA editing in mammals:new members of the APOBEC family seeking roles in the family business［J］.Trends Genet,2003,19（4）:207-216.

［3］Cascalho M.Advantages and disadvantages of cytidine deamination［J］.J Immunol,2004,172（11）:6513-6518.

［4］Kong Y,Si L,Guo J,et al.Aberrations of KIT,BRAF,NRAS,and PDGFRA in Chinese melanoma patients and their significance: Large,scale analysis of 644 patients［J］.J Clin Oneol,2011,29（15）:8568.

［5］郭芳,康曉靜,唐小輝,等.新疆80例惡性黑素瘤BRAF基因突變分析［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（1）:33-36.

［6］Okura R,Yoshioka H,Yoshioka M,et al.Expression of AID in malignant melanoma with BRAF（V600E）mutation［J］.Exp Dermatol,2014,23（5）:347-348.

Correlation analysis between activation-induced cytidine deaminase expression and melanoma invasion, metastasis and prognosis

Peng Lyujiao*,Kang Xiaojing,Yilinuer Halifu,Chai Li,Li Na.*Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832002,Xinjiang,China
Corresponding author:Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

ObjectiveTo explore the relationship between activation-induced cytidine deaminase（AID）expression and melanoma invasion,metastasis and prognosis,and to evaluate the clinical significance of AID.MethodsAn immunohistochemical study was conducted to detect the expression of AID in paraffin-embedded tissue sections from 80 cases of melanoma and 23 cases of pigmented nevus.The relationship between the expression of AID and clinicopathological and biological features of melanoma was analyzed.ResultsThe expression rate of AID was significantly higher in melanoma than in pigmented nevus tissue specimens（53.75%（43/80）vs.13.04%（3/23）,P＜0.05）.AID expression was closely correlated with lymphatic metastasis,Clark grade,depth of invasion and prognosis of melanoma（allP＜0.05）,but was of no significant difference among patients of different age,gender or nationalities（allP＞0.05）.Of 19 melanoma specimens with BRAF mutations,17 expressed AID,including all the 15 melanoma specimens with the BRAFV600E mutation.ConclusionsAID may induce BRAF mutations in melanoma,participate in melanoma invasion and metastasis,and be correlated with melanoma prognosis.

Melanoma;Prognosis;Neoplasm metastasis;Mutation;Activation-induced cytidine deaminase

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.015

新疆維吾爾自治區(qū)國際科技合作計劃項目（20146022）

832002新疆石河子大學醫(yī)學院（彭呂嬌）；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（康曉靜，伊力努爾·哈力甫）；新疆石河子大學醫(yī)學院（李娜）；新疆醫(yī)科大學（柴莉）

康曉靜，Email：drkangxj666@163.com

2014-11-04）

（本文編輯：吳曉初）