高 原 王 哲 于 丹 王 瑩 井 歡 潘 茜 趙金茹 王守巖 關(guān)洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是缺血性腦卒中的主要病理機(jī)制，腦血流中斷和再灌注使腦細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)的惡性循環(huán)導(dǎo)致機(jī)體處于持續(xù)的惡性應(yīng)激刺激狀態(tài)。急性缺血性腦卒中為臨床常見病，其發(fā)病率、致殘率及死亡率在全世界范圍內(nèi)占有很高的比例，成為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)主要的研究課題。近年來(lái)，在臨床上針灸治療該病已取得可喜的療效〔1〕，包括眼針療法、體針療法、頭針療法等。臨床傳統(tǒng)治療中風(fēng)常用針刺曲池、足三里兩穴。本研究觀察眼針與體針對(duì)急性CIRI大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)變化的影響，旨在探討兩種療法對(duì)CIRI效應(yīng)的差異性，為眼針療法自成診療體系提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康SD大鼠48只，雌雄不拘，體重(280±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號(hào):SCXK(京)2007-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，自由飲水、攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室內(nèi)溫度22℃，相對(duì)濕度45%。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、眼針穴區(qū)組、眼針穴區(qū)外組與體針組六組，每組8只。

1.2模型制備與評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)〔2〕，模型組、眼針穴區(qū)組、眼針穴區(qū)外組與體針組均采用改良的線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。模型成功標(biāo)準(zhǔn):大鼠于缺血2 h后進(jìn)行再灌注，再灌注后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，參照Z(yǔ)ea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔3〕:0分為無(wú)癥狀;1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分為1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。假手術(shù)組術(shù)式同模型組，區(qū)別在于釣魚線插入深度為0.5～1 cm，其他同模型組。正常對(duì)照組未處理。

1.3眼針取穴及刺法 眼針穴區(qū)組取穴:用31號(hào)13 mm毫針，定位參照人體取穴方法〔4〕，取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺。于大鼠眶緣處，采用眶上橫刺法，按照穴區(qū)定位線1→8的順序，從該穴區(qū)定位線一端進(jìn)針，橫刺進(jìn)針3 mm，到另一定位線，留針20 min，10 min時(shí)刮針1次，刮針5下。治療時(shí)機(jī):于腦缺血再灌注即刻及其取材前30 min分別進(jìn)行眼針治療2次。眼針穴區(qū)外組取穴:選擇眼針同名穴區(qū)的外3 mm處為針刺部位，刺法與眼針穴區(qū)相同。

1.4體針取穴及刺法 體針組取穴:按照《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》的方法取穴，并參照人體有關(guān)穴位，以動(dòng)物比較學(xué)方法定位。取曲池穴(大鼠曲池穴位置為肘關(guān)節(jié)前外側(cè)凹陷中，針法為直刺5 mm)及足三里穴(大鼠足三里穴位置為膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約5 mm處，針法為斜刺1 cm)。

1.5試劑 親和純化兔抗鼠BDNF多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa大連寶生物。BDNF引物由北京華大基因公司合成。

1.6Western印跡方法 于缺血再灌注3 h后對(duì)大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦皮質(zhì)，按腦皮質(zhì)凈重:裂解液=1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液，pH值為7.5，將樣品剪碎后勻漿、離心，上清即為總蛋白。等量的細(xì)胞蛋白提取物通過SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，PVDF膜在封閉緩沖液中封閉2 h，孵育一抗緩沖液(BDNF 1∶500)，4℃過夜。次日，室溫下孵育HRP-標(biāo)記的二抗緩沖液(1∶3 000)2 h。O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 顯色。掃描儀掃描NC膜，分析結(jié)果。

1.7實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法 采用Trizol試劑提取腦組織總RNA，應(yīng)用Quant Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以適量cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增BDNF基因片段，BDNF基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為86 bp，β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物為132 bp。BDNF上游引物:5'ATGGGTTACACGAAGGA 3';BDNF下游引物:5'GCCCGAACATACGATT 3'。β-actin上游引物:5'CGTGCGTGACATTAAAGAG 3'，下游引物5'TTGCCGATAGTGATGACCT 3'。所有的產(chǎn)物，在 ABI Prism 7500 HT序列檢測(cè)系統(tǒng)中運(yùn)行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內(nèi)參，以擴(kuò)增倍數(shù)作為比較的依據(jù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分 正常對(duì)照組和假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)，腦缺血再灌注3 h后模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時(shí)左側(cè)前肢不能伸直，行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等，表明CIRI大鼠模型復(fù)制成功。與模型組比較，眼針穴區(qū)組和體針組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低(P＜0.01)，但兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);眼針穴區(qū)外組評(píng)分接近模型組，與眼針穴區(qū)組、體針組差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠CIRI 3 h后神經(jīng)缺損評(píng)分(x ± s，n=8)

2.2CIRI 3 h后各組大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白的表達(dá) 采用Western印跡方法檢測(cè)大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白，模型組大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P＜0.01)。與模型組比較，眼針穴區(qū)組、體針組和眼針穴區(qū)外組大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)均上調(diào)(P＜0.01)，但以眼針穴區(qū)組與體針組升高較明顯，且兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。眼針穴區(qū)外組大鼠腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)較眼針穴區(qū)組、體針組顯著下調(diào)(P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠CIRI 3 h后腦皮質(zhì)BDNF蛋白及mRNA的表達(dá)(x ± s，n=8)

2.3CIRI 3 h后各組大鼠腦皮質(zhì)BDNF mRNA的表達(dá) 實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)腦皮質(zhì)BDNF mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，模型組大鼠腦皮質(zhì)BDNF mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組、假手術(shù)組顯著減少(P＜0.01)。與模型組相比，眼針穴區(qū)組、體針組和眼針穴區(qū)外組大鼠腦皮質(zhì)BDNF mRNA表達(dá)均升高(P＜0.01)，但以眼針穴區(qū)組與體針組升高較明顯，且兩組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。眼針穴區(qū)外組大鼠腦皮質(zhì)BDNF mRNA表達(dá)較眼針穴區(qū)組、體針組顯著降低(P＜0.01)。見表2。

3討論

缺血性腦卒中主要是由于心、肝、脾、腎等臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，虛、火、風(fēng)、痰、瘀互為影響，致使機(jī)體氣血逆亂，脈絡(luò)瘀阻而發(fā)病。眼針療法是彭靜山教授根據(jù)中醫(yī)學(xué)“諸經(jīng)皆屬于目”以及在后世醫(yī)家的“五輪”“八廓”理論基礎(chǔ)上，結(jié)合“八卦”學(xué)說(shuō)，按照八卦方位將眼眶四周分為等份的八個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)代表一個(gè)卦位，即乾、坎、艮、震、巽、離、坤、兌;在八區(qū)的基礎(chǔ)上再依據(jù)經(jīng)絡(luò)臟腑的聯(lián)屬關(guān)系配以臟腑穴區(qū)，總計(jì)十三穴區(qū)，即肺穴、大腸穴、腎穴、膀胱穴、上焦穴、肝穴、膽穴、中焦穴、心穴、小腸穴、脾穴、胃穴、下焦穴〔5〕?！坝^眼識(shí)證”即根據(jù)“五輪”或“八廓”上的白睛血絡(luò)變化進(jìn)行辨證，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)“諸經(jīng)系五輪，八廓應(yīng)臟腑”的思維，從上述八區(qū)中選取相應(yīng)穴位進(jìn)行針刺，從而達(dá)到“通經(jīng)調(diào)氣血”以防治疾病的效果。臨床上體針治療該病多采用“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的選穴原則，陽(yáng)明經(jīng)多氣多血，主潤(rùn)宗筋，陽(yáng)明虛則宗筋縱;陽(yáng)明經(jīng)腧穴既能灌其中土、榮養(yǎng)四肢，又可疏通經(jīng)絡(luò)、運(yùn)行氣血。宿寶貴等〔6〕發(fā)現(xiàn)電針曲池、足三里兩穴能有效地減小腦梗死面積并可保護(hù)梗死邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。同時(shí)，蔡玉穎等〔7〕研究顯示電針曲池、足三里兩穴能減輕CIRI的神經(jīng)功能缺損癥狀。因此本實(shí)驗(yàn)中體針療法選擇了針刺曲池、足三里兩穴，該療法也是目前療效最為顯著、臨床應(yīng)用最為廣泛的一種治療急性缺血性腦卒中的方法。眼針與體針在改善CIRI方面的作用上是否存在著差異，至今尚無(wú)報(bào)道。因此，探討和闡明眼針療法與體針療法對(duì)急性CIRI模型大鼠效應(yīng)的差異性及其可能機(jī)制，為眼針療法自成診療體系提供相關(guān)依據(jù)。

BDNF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族重要成員之一，是由Barde等在1982年從豬腦中首先分離和純化的神經(jīng)生長(zhǎng)因子。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，BDNF對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)，而且也是成熟的中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元維持生存及正常生理功能所必需。BDNF廣泛分布在腦中樞各個(gè)部位，包括大腦皮層、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦和小腦等。BDNF能促進(jìn)神經(jīng)元生存、延緩變性的自然死亡，參與腦缺血損傷的保護(hù)過程。Lee等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)在缺血較敏感的CA1區(qū)，BDNF的免疫反應(yīng)性和BDNF mRNA間存在長(zhǎng)期的表達(dá)差異，BDNF的水平很快下降;而在缺血耐受的齒狀回只存在較短暫的表達(dá)差異，且能維持BDNF的水平。林百喜等〔9〕采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞再灌流模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定腦缺血后3 d、7 d以及30 d腦內(nèi)BDNF蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BDNF主要表達(dá)于缺血組大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)、海馬、缺血灶周圍等處。腦缺血后3 d，上述部位BDNF的表達(dá)增高，7 d后其表達(dá)水平繼續(xù)增強(qiáng)達(dá)高峰，30 d后BDNF表達(dá)水平降低。陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)于神經(jīng)元，其中在7 d、30 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，兩組陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異有顯著性，結(jié)果表明腦缺血后BDNF蛋白的表達(dá)呈時(shí)段性增高。這些結(jié)果都充分說(shuō)明BDNF參與了CIRI的保護(hù)過程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明眼針和體針均可改善CIRI動(dòng)物的一般狀態(tài)，而針刺眼針穴區(qū)外對(duì)急性CIRI動(dòng)物的神經(jīng)損傷無(wú)明顯改善作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在CIRI 3 h后，眼針穴區(qū)組、體針組和眼針穴區(qū)外組大鼠腦皮質(zhì)BDNF無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平均迅速上調(diào)，眼針穴區(qū)組和體針組結(jié)果升高尤為顯著，表明眼針和體針均通過增強(qiáng)BDNF表達(dá)以延緩神經(jīng)元的變性、壞死，增強(qiáng)其抗損傷的能力，兩種針刺療法可能通過相似的途徑治療急性CIRI。針刺眼針穴區(qū)外的大鼠腦皮質(zhì)BDNF的含量也有所上調(diào)，但其結(jié)果遠(yuǎn)低于眼針穴區(qū)組和體針組，說(shuō)明針刺眼針非穴區(qū)對(duì)BDNF表達(dá)也有輕微影響作用，但是與眼針、體針比較其作用較弱，且此BDNF表達(dá)的改變并不足以改善神經(jīng)功能缺損癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)眼針影響急性CIRI模型的機(jī)制可能與上調(diào)腦皮質(zhì)BDNF的表達(dá)，從而增強(qiáng)急性CIRI時(shí)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)有關(guān)〔10，11〕。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)證明眼針與體針在改善急性CIRI的作用上比較相似，兩種療法可能均與上調(diào)腦皮質(zhì)BDNF的表達(dá)，從而增強(qiáng)神經(jīng)元的抗損傷能力有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，眼針療法與體針療法的效果相近，但眼針療法因其取穴少，安全方便，易于掌握，在臨床中越來(lái)越受到人們的重視。

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