蔡 健，華 平，胡志敏，王世鳳，王璽皓，余 波

(成都市婦女兒童中心醫(yī)院病理科，成都610092)

眾所周知，卵巢和子宮內(nèi)膜都可以發(fā)生子宮內(nèi)膜樣癌和漿液性癌，按目前流行的卵巢、子宮內(nèi)膜癌的二元論分類，認(rèn)為高級(jí)別的漿液性癌的預(yù)后要明顯差于子宮內(nèi)膜樣癌，因此，不管腫瘤發(fā)生在卵巢還是子宮體，鑒別二者顯得非常重要［1-2］。大量的研究表明p53、p16的表達(dá)情況對(duì)于鑒別二者起到非常重要的作用。我們將通過(guò)回顧性研究一組病例來(lái)闡明和進(jìn)一步印證p53、p16在這兩種疾病中的表達(dá)特征和差別。

1 材料及方法

1．1 材料

66例發(fā)生在卵巢或子宮內(nèi)膜的被診斷為高級(jí)別漿液性癌或子宮內(nèi)膜樣癌的標(biāo)本均選自我院2012～2015年病理科的存檔蠟塊(在本研究中并不特別去區(qū)分腫瘤是發(fā)生在卵巢還是子宮內(nèi)膜)，標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋。所有病例診斷參照WHO第四版標(biāo)準(zhǔn)?；颊吣挲g從42～71歲，平均年齡(56 ±2．5)歲。

1．2 方法

將選定的存檔石蠟塊重新制成2～4μm的切片，蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化染色，光鏡觀察;免疫組化染色采用SP法，鼠抗人單克隆抗體p16，p53及SP試劑盒均購(gòu)自廣州太陽(yáng)生物有限公司，抗體工作濃度1∶100，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知p16、p53陽(yáng)性的漿液性癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):p53陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽(yáng)性;p16陽(yáng)性定位于細(xì)胞漿、細(xì)胞膜或細(xì)胞核，以出現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽(yáng)性?！?或+-”為無(wú)或不足5%的陽(yáng)性細(xì)胞;“+”為5%～29%的腫瘤細(xì)胞著色，被認(rèn)為弱陽(yáng)性;“++”為約30%～69%的腫瘤細(xì)胞著色，中強(qiáng)陽(yáng)性;“+++”為70%以上的腫瘤細(xì)胞著色，強(qiáng)陽(yáng)性;在判定過(guò)程中結(jié)合細(xì)胞著色的強(qiáng)度進(jìn)行綜合評(píng)判，比如超過(guò)70%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性，但著色為中等強(qiáng)度，給予++的評(píng)判。然后對(duì)免疫組化結(jié)果半定量數(shù)值化，數(shù)值化規(guī)則如下:-或+-記為0分，+記為1分，++記為2分，+++記為3分，根據(jù)數(shù)值化結(jié)果建立數(shù)值化表。

1．3 工作方式

采用雙盲法，即在結(jié)果出來(lái)之前組織學(xué)診斷和免疫組化結(jié)果判定分別獨(dú)立進(jìn)行，二者判定過(guò)程不彼此影響。閱片人員由一位副主任醫(yī)師，一位高年資主治醫(yī)師及一位住院醫(yī)師完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19．0軟件，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)和線性相關(guān)分析，P＜0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 免疫組化結(jié)果

66例病例中30例診斷為高級(jí)別漿液性癌，其鏡下特點(diǎn)為:癌組織分化較低，呈復(fù)雜的小乳頭或成片實(shí)體結(jié)構(gòu)，三級(jí)核，眾多的核分裂、凋亡，p53免疫組化染色:13 例(43．3%)強(qiáng)陽(yáng)性，10 例(33．3%)中強(qiáng)陽(yáng)性，7例(23．4%)弱陽(yáng)性，無(wú)陰性表達(dá);p16免疫組化染色:8 例(26．6%)強(qiáng)陽(yáng)性，9 例(30．0%)中等強(qiáng)度陽(yáng)性，10例(33．4%)弱陽(yáng)性，3例(10．0%)陰性;36例被診斷為子宮內(nèi)膜樣癌，其組織學(xué)特點(diǎn)是分化較好，呈腺樣或絨毛腺樣，無(wú)或很少實(shí)體片狀結(jié)構(gòu)，核異型性不大，核分裂及凋亡少見(jiàn)，免疫組化染色，僅1 例(2．8%)p53 呈強(qiáng)陽(yáng)性，3 例(8．3%)中強(qiáng)陽(yáng)性，32例(88．9%)為陰性或弱陽(yáng)性，同時(shí)有2例(5．6%)p16呈中強(qiáng)陽(yáng)性，其余的均為陰性或弱陽(yáng)性(見(jiàn)圖1～4，表1、2)。

圖1 p16(+++)，卵巢漿液性癌示胞漿及胞核強(qiáng)著色(×200倍)

圖2 p53(+++)，同上例，切片中同一區(qū)域，胞核強(qiáng)著色(×200倍)

圖3 p16(+++)，宮內(nèi)膜漿液性癌，胞漿及胞核強(qiáng)著色(×100倍)

圖4 p53(++)，同上例，切片中同一區(qū)域胞核中等強(qiáng)度著色(×100倍)

表1 30例漿液性癌p53、p16免疫組化結(jié)果及其數(shù)值化結(jié)果

表2 36例子宮內(nèi)膜樣癌的p53、p16免疫組化結(jié)果及p53的數(shù)值化結(jié)果

2．2 p53、p16在漿液性癌和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及相關(guān)性

根據(jù)數(shù)據(jù)資料，為使p53結(jié)果更加客觀，規(guī)定免疫組化數(shù)值大于或等于2屬于病理性表達(dá)，小于或等于1屬于非病理性表達(dá)。理由:野生型p53經(jīng)常和mdm2發(fā)生作用導(dǎo)致其半衰期極短［3-4］，不容易被檢測(cè)到，而突變型的p53蛋白由于容易和其他分子結(jié)合從而屏蔽了與mdm2的相互作用［3］，導(dǎo)致其在核內(nèi)濃度提高，容易被檢測(cè)到。結(jié)合表1、2數(shù)值可得如表3所示p53在子宮內(nèi)膜樣癌及漿液性癌中的病理性表達(dá)和非病理性表達(dá)結(jié)果。

表3 p53在漿液性癌及子宮內(nèi)膜樣癌中的病理性表達(dá)和非病理性表達(dá)合計(jì)表(例)

計(jì)算的Pearson卡方值 =29．091，差異性顯著(P＜0．001)，推斷出漿液性癌中p53的病理性表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣癌中p53的病理性表達(dá)差異非常顯著(P ＜0．001)。

另一方面，根據(jù)表1的抽樣數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出在漿液性癌中p16、p53表達(dá)情況的Spearman相關(guān)系數(shù) (Correlation coefficient)［5］:r(Xp16，Xp53)=0．36，呈弱正相關(guān)(顯著水平 P=0．05)，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;由此我們認(rèn)為至少在統(tǒng)計(jì)學(xué)層面p16和p53就線性關(guān)系而言存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)(P≤0．05)。

由此得出結(jié)論:1、高級(jí)別漿液性癌與p53的突變強(qiáng)相關(guān)，而子宮內(nèi)膜樣癌基本不存在p53的改變(P＜0．005)。2、在高級(jí)別漿液性癌中，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)p53的表達(dá)似乎與p16的表達(dá)存在某種內(nèi)在聯(lián)系，即二者在這類癌癥中存在同時(shí)陽(yáng)性的傾向(弱線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r=0．33，顯著水平 P≤0．05)。

3 討論

在所有女性惡性腫瘤中，發(fā)生在子宮內(nèi)膜和卵巢的子宮內(nèi)膜樣癌(endometrioid carcinoma)及高級(jí)別漿液性癌(HGSCs)占了很大的比例，近20年國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者從形態(tài)學(xué)、組織發(fā)生學(xué)、免疫組化及分子生物學(xué)等角度的廣泛研究，使人類對(duì)這類腫瘤有了相對(duì)透徹的了解，直至形成現(xiàn)在廣泛流行的子宮內(nèi)膜及卵巢癌二元發(fā)病模型(dualistic model of carcinogenesis)，即將這類腫瘤分為Ⅰ型和Ⅱ型，本文中子宮內(nèi)膜樣癌和高級(jí)別漿液性癌分別代表Ⅰ型和Ⅱ型。

Ⅰ型特征性地發(fā)生ERBB2/PI3K/AKT(PKB)/mTOR/cyclinD1或ERBB2/KRAS/BRAF(MAPKKK)/MEK(MAPKK)/ERK(MAPK)信號(hào)通路異常［4］，分化相對(duì)較高，生物學(xué)行為較惰性，因此惡性程度較低;Ⅱ型，則特征性地發(fā)生p53突變，分化較低，生物學(xué)行為高度侵襲。由于生物學(xué)行為的顯著不同，準(zhǔn)確區(qū)分它們?cè)谂R床上顯得非常重要［6-8］。從形態(tài)學(xué)角度，子宮內(nèi)膜樣癌總顯示一定程度的器官樣分化，呈腺樣或乳頭狀，很少呈實(shí)體片狀，癌細(xì)胞總顯示一定的分化程度，異型性不是很大;而高級(jí)別漿液性癌，癌細(xì)胞常常排列成實(shí)體片狀，可見(jiàn)纖細(xì)的小乳頭，細(xì)胞分化程度低，異型性大。這種形態(tài)學(xué)的差異，本質(zhì)上是由癌細(xì)胞分化程度的高低決定的，前者為中高分化，后者為低分化或未分化，這也是二元論在癌細(xì)胞分化方面的體現(xiàn);從免疫組織化學(xué)角度，p53的高表達(dá)與癌細(xì)胞的低分化相聯(lián)系，低表達(dá)則與高分化相聯(lián)系，這是二元論在p53方面的體現(xiàn)。本研究中p53在漿液性癌和子宮內(nèi)膜樣癌中表達(dá)的顯著差異，佐證了這樣的差別，并顯示形態(tài)學(xué)分類和分子分類(根據(jù)p53的表達(dá)情況)具有高度的一致性。

另一方面，本研究顯示了p16在HGSCs的表達(dá)特征。如前所述，由于p53蛋白的生化特點(diǎn)，其陽(yáng)性提示TP53基因的突變。p16蛋白的異常表達(dá)反映P16基因怎樣的狀況呢?一般而言蛋白質(zhì)的異常表達(dá)可以出現(xiàn)在基因缺失、基因擴(kuò)增、染色體畸變、基因突變或者受別的異常生物分子(轉(zhuǎn)錄因子)的影響。在本研究免疫組化切片中我們經(jīng)常觀察到p53和p16表達(dá)的一致性，即它們傾向于在腫瘤的同一區(qū)域陽(yáng)性(如圖1、2)，即使是灶性區(qū)域陽(yáng)性，很多情況下陽(yáng)性細(xì)胞的空間分布也是一致的，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度考慮，這種現(xiàn)象可能并非偶然。這一事實(shí)使我們有理由認(rèn)為高級(jí)別漿液性癌p16的異常表達(dá)與突變的p53有關(guān)，即p16的異常表達(dá)系基因異常轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致，傾向于異常p53上調(diào)p16，即突變的p53蛋白可能通過(guò)磷酸化的pRB反饋性地上調(diào)p16INK4a/p14ARF(這兩個(gè)抑癌基因共用2個(gè)相同的外顯子，由于讀碼框移位，從而表達(dá)不同的蛋白質(zhì));本研究結(jié)果顯示p53和p16之間的確存在一定程度的線性關(guān)系。在文獻(xiàn)報(bào)道中，強(qiáng)調(diào)了在生理?xiàng)l件下p16基因的一個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物ARF(alternate open reading frame，又名p14ARF等)，通過(guò)屏蔽泛素蛋白連接酶MDM2，穩(wěn)定野生型p53蛋白，延長(zhǎng)了其半衰期，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用的一個(gè)方面，且在病理狀態(tài)p16INK4a/p14ARF表達(dá)也常常被上調(diào)［9-10］。因此在HGSCs情形，我們認(rèn)為p16INK4a/p14ARF可能由于突變的p53蛋白的存在而被上調(diào)，而p14ARF又阻止p53蛋白(可能包括突變型)降解，從而形成一個(gè)正反饋環(huán)路，強(qiáng)化突變p53的致瘤作用。這是基于免疫組化觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果的關(guān)于p53和p16在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的協(xié)同關(guān)系的一個(gè)猜測(cè)，事實(shí)是否如此尚有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了p53的異常表達(dá)(TP53突變)在子宮內(nèi)膜樣癌和高級(jí)別漿液性癌中的差別，并描述了它們不同的病理臨床特征，由此說(shuō)明準(zhǔn)確區(qū)分它們具有重要的臨床意義;提示了p53的異常表達(dá)在診斷過(guò)程中的重要作用;另一方面，通過(guò)p16的表達(dá)特點(diǎn)，及與p53的統(tǒng)計(jì)學(xué)聯(lián)系，提示p16與p53之間可能存在的內(nèi)在關(guān)系。這些結(jié)果及可能關(guān)系加深了我們對(duì)該類腫瘤的理解，并促進(jìn)我們繼續(xù)去研究該腫瘤的發(fā)生發(fā)展問(wèn)題，揭示疾病更多的本質(zhì)，為解決臨床問(wèn)題提供可能存在的幫助。關(guān)于p53、p16與女性生殖道上皮低分化癌之間關(guān)系更詳盡的分子機(jī)制，本資料中并未提示，核內(nèi)詳盡分子機(jī)制(如p53-p16的精確調(diào)控關(guān)系及臨床應(yīng)用等)更有待進(jìn)一步深入研究，以揭示更本質(zhì)的腫瘤信息，并運(yùn)用于臨床實(shí)踐。

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