銀杏達(dá)莫注射液對(duì)血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)神經(jīng)元干預(yù)作用

王艷　王珂

[摘 要] 目的：觀察銀杏達(dá)莫注射液對(duì)血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶及海馬區(qū)神經(jīng)元干預(yù)作用。 方法：大鼠分為三組：假手術(shù)組、安慰劑組、銀杏達(dá)莫組。采用改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷方法制備血管性癡呆大鼠模型。利用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，顯微鏡觀察海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與假手術(shù)相比，安慰劑組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），而銀杏達(dá)莫組大鼠平均潛伏期較安慰劑組明顯減少（P<0.05）。形態(tài)學(xué)觀察顯示安慰劑組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量較少，甚至神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡。銀杏達(dá)莫組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)較安慰劑組均有明顯改善。結(jié)論：銀杏達(dá)莫注射液對(duì)VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，從而改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

[關(guān)鍵詞] 血管性癡呆；大鼠；銀杏達(dá)莫；海馬區(qū)；學(xué)習(xí)記憶

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095-5200（2015）06-030-03

DOI：10.11876/mimt201506012

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是指各種腦血管疾病引起腦功能障礙而產(chǎn)生的獲得性智能損害綜合癥，以高級(jí)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙，如學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能受損等為主要表現(xiàn)，可伴有一系列異常神經(jīng)心理癥狀和精神行為，是繼阿爾茨海默病之后第二大癡呆疾。VD可以防治，早期治療，具有可逆性[1-2]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道：銀杏達(dá)莫注射液具有改善腦部微循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、清除自由基、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善由于腦缺血引起癥狀和記憶功能等功效[3]。銀杏達(dá)莫注射液對(duì)血管性癡呆具有較好臨床療效，但機(jī)制研究證據(jù)較少。本研究在動(dòng)物模型上觀察銀杏達(dá)莫注射液對(duì)血管性癡呆治療效果及可能的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)對(duì)象為健康雄性SD大鼠，數(shù)量30只，體重在250～300g，SPF級(jí)。OPJ-1B型切片機(jī)由天津天利航空機(jī)電有限公司生產(chǎn)；80i正置顯微鏡由日本Nikon生產(chǎn)；Morris水迷宮由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制生產(chǎn)。銀杏達(dá)莫注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H52020032），由貴州益佰制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與分組

SD大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，采用Morris水迷宮篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，淘汰不能勝任水迷宮大鼠。將符合要求大鼠隨機(jī)選出20只，改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷方法制備血管性癡呆動(dòng)物模型，余下10只為假手術(shù)組，給予相應(yīng)手術(shù)處理但不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈。手術(shù)死亡大鼠剔除實(shí)驗(yàn)，并補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)目大鼠。術(shù)后第2天將造模大鼠，隨機(jī)分為2組：銀杏達(dá)莫組給予銀杏達(dá)莫注射液（劑量為2.7mg/kg）靜脈注射 [4]，安慰劑組、假手術(shù)組給予等體積生理鹽水靜脈注射，療程為2周[5]。治療結(jié)束后，利用Morris水迷宮裝置對(duì)各組大鼠進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，記錄各組大鼠逃避潛伏期。

1.3 制備血管性癡呆動(dòng)物模型

改良雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CAA）阻斷法制備血管性癡呆模型[6]。術(shù)前12h禁食，10%水合氯醛（350mg/kg體重）腹腔麻醉，取仰臥位，固定于手術(shù)臺(tái)上；行相關(guān)手術(shù)前準(zhǔn)備，頸部正中切口，依次切開皮膚、皮下組織，分離肌肉、血管、神經(jīng)，充分暴露一側(cè)頸總動(dòng)脈，給予結(jié)扎、剪斷該血管；依次縫合肌肉、皮下組織及皮膚。間隔7天后，同樣方法再次處理對(duì)側(cè)頸總動(dòng)脈。

1.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定

利用Morris水迷宮對(duì)各組大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶評(píng)估[7]。定位航行實(shí)驗(yàn)（水下任務(wù)實(shí)驗(yàn)），記錄大鼠從入水至爬上平臺(tái)時(shí)間，即逃避潛伏期。逃避潛伏期長(zhǎng)短可以客觀反映大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。連續(xù)進(jìn)行5天定向航行試驗(yàn)，每日4次（上午、下午各2次）。大鼠第5天4次平均逃避潛伏期為該大鼠最終測(cè)試時(shí)間。

1.5 大鼠腦組織HE切片

大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350mg/Kg）腹腔麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水50mL，再用含2%多聚甲醛、1%戊二醛混合液100～250mL灌注固定，時(shí)間不超過(guò)6min，1h后取腦，每個(gè)標(biāo)本放入4%多聚甲醛PBS溶液中固定4～6h，沿矢狀位切成小塊，在30%蔗糖溶液中脫水12h后包埋于石蠟中。采用蘇木素-伊紅（HE染色）腦組織切片，光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠癥狀表現(xiàn)

雙側(cè)頸總動(dòng)脈假阻斷術(shù)后當(dāng)日大鼠表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)減少、進(jìn)食及飲水較少，之后逐漸恢復(fù)。術(shù)后2周時(shí)假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)為進(jìn)食水、活動(dòng)及精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度恢復(fù)至術(shù)前水平。安慰劑組表現(xiàn)為大鼠進(jìn)食、飲水逐漸恢復(fù)，目光遲鈍，活動(dòng)量較術(shù)前明顯減少，毛發(fā)臟亂，缺少光澤，對(duì)外界刺激反應(yīng)淡漠。銀杏迖莫組大鼠表現(xiàn)為活動(dòng)量較手術(shù)前稍減少、毛發(fā)粗糙、欠光澤，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍。

2.2 大鼠定位航行試驗(yàn)

假手術(shù)組平均逃避潛伏期為（12.91±4.86）s；安慰劑組平均逃避潛伏期為（36.92±7.64）s。與假手術(shù)組相比，血管癡呆組平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P<0.05），說(shuō)明該組SD大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能受損。而銀杏達(dá)莫組大鼠平均逃避潛伏期為（28.23±7.21）s。與安慰劑組相比，銀杏達(dá)莫組平均逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05），但與假手術(shù)組相比，銀杏達(dá)莫組平均逃避潛伏期仍延長(zhǎng)（P<0.05）。

2.3 銀杏達(dá)莫對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元

影響

假手術(shù)組SD大鼠腦海馬CA1區(qū)HE染色顯示：海馬區(qū)CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或橢圓型，細(xì)胞核染成淡藍(lán)色，與細(xì)胞槳界限清晰，細(xì)胞排列緊密，外形規(guī)則，呈3～5層排列，未見異常結(jié)構(gòu)（見圖A）。安慰劑組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色可見：海馬錐體細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核與胞漿分界不清，出現(xiàn)核固縮、變形，可見軟化灶、細(xì)胞壞死明顯（見圖B）。銀杏達(dá)莫組海馬區(qū)組織切片可見：細(xì)胞體積變大，細(xì)胞水腫，細(xì)胞局部壞死；細(xì)胞排列較整齊，可見多層排列輪廓，海馬CA1神經(jīng)元數(shù)目、形態(tài)較安慰劑組均有明顯改善（見圖C）。

3 討論

銀杏達(dá)莫注射液是以銀杏葉提取物為基礎(chǔ)復(fù)合制劑，主要有效成分為銀杏內(nèi)酯類、銀杏黃酮苷、百果內(nèi)酯、雙嘧達(dá)莫等；具有改善微循環(huán)、抗血小板聚集、清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等多重藥理作用，可以防止細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、拮抗谷氨酸等興奮性氨基酸引起神經(jīng)毒性[8-9]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，銀杏達(dá)莫注射液對(duì)血管性癡呆治療預(yù)防療效確切，但其治療血管性癡呆機(jī)制尚未闡明[5，10]。本研究通過(guò)觀察銀杏達(dá)莫注射液對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞影響，探討VD發(fā)病機(jī)制和銀杏達(dá)莫治療VD作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，其所測(cè)量指標(biāo)為大鼠逃避潛伏期；逃避潛伏時(shí)間越長(zhǎng)，學(xué)習(xí)記憶能力越差。本研究顯示：銀杏達(dá)莫組大鼠平均逃避潛伏期較安慰劑組明顯縮短（P<0.05）；但與假手術(shù)組相比，銀杏迖莫組平均逃避潛伏期仍延長(zhǎng)（P<0.05）。因此，該研究表明銀杏達(dá)莫注射液可以有效改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，但不能使其達(dá)到正常大鼠學(xué)習(xí)記憶水平。

海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)主要組成部分，參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)等功能活動(dòng)，被認(rèn)為學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵腦區(qū)[11]。臨床上，學(xué)習(xí)記憶受損常是血管性癡呆患者首發(fā)和較為突出癥狀。研究表明，血管性癡呆患者學(xué)習(xí)記憶受損與海馬區(qū)神經(jīng)元變性、壞死、凋亡關(guān)系密切[12-15]。本研究也顯示：銀杏達(dá)莫組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞較少表現(xiàn)為變性、壞死及凋亡特征，其神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目明顯多于安慰劑組。海馬與動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切。由此可以推測(cè)，銀杏達(dá)莫改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其可能通過(guò)增強(qiáng)海馬區(qū)神經(jīng)元對(duì)缺氧耐受、抑制海馬區(qū)神經(jīng)元壞死及凋亡、修復(fù)損傷神經(jīng)等多靶點(diǎn)調(diào)控機(jī)制，從而保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量及功能。

綜上所述，本研究顯示：銀杏達(dá)莫注射液通過(guò)對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用，顯著改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其可能機(jī)制為減輕腦缺血再灌注損傷，抑制海馬神經(jīng)元壞死、凋亡，修復(fù)神經(jīng)損傷。但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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